第五章微生物的生長及控制個體生長——微生物細胞的重量和體積不斷增大的過程。個體繁殖——微生物細胞產生新的生命個體，即引起生命個體數量增加的生物學過程。群體生長——群體中個體數目和重量的增加。可以用重量、體積、密度或濃度來衡量。

群體生長=個體生長+個體繁殖生長與繁殖的概念單個細胞或一種細胞群繁殖得到的后代。對于微生物，由于其主要進行無性f繁殖，故純培養即為克隆。建立純培養，證實其純度無可置疑并保

持不受污染是微生物學家最重要的任

務之一。純培養（pureculture）：第一節微生物的純培養用固體培養基分離純培養用液體培養基分離純培養單孢子或單細胞分離法利用選擇性培養基分離法一、用固體培養基分離純培養（菌落分離法）1.平板劃線分離法

用接種環以菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續劃線，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養后，可在平板表面得到單菌落。分區劃線（適用于濃度較大的樣品）

連續劃線（適用于濃度較小的樣品）分段劃線和連續劃線2.稀釋倒平板法3.涂布平板法簡單易行，但易造成機械損傷涂布平板法連續稀釋,目的是使一支試管中分配不到一個微生物。適合于優勢微生物.二、用液體培養基分離純培養（液體稀釋法）三、單孢子或單細胞分離法采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養以獲得純培養。在顯微鏡下使用單孢子分離器進行機械操作，挑取單孢子或單細胞進行培養。也可以采用特制的毛細管在載玻片的瓊脂涂層上選取單孢子并切割下來，然后移到合適的培養基進行培養。四、選擇性培養基分離法為了從混雜的微生物群體中分離出某種微生物，可以根據該微生物的特點，包括營養、生理、生長條件等，采用選擇培養的方法進行分離。＊利用選擇培養基進行直接分離＊富集培養微生物純培養分離方法的比較分離方法應用范圍平皿劃線法方法簡便，多用于分離細菌稀釋倒平皿法即可定性，又可定量，用途廣泛單細胞挑取法局限于高度專業化的科學研究利用選擇培養基法適用于某些生理類型較特殊的微生物第二節微生物生長的測定評價不同的抗菌物質對微生物產生抑制(或殺死)作用的效果；客觀地反映微生物生長的規律；評價培養條件、營養物質等對微生物生長的影響；微生物生長微生物生長測量方法計數法重量法生理指標法一、計數法1直接法（全數法）1）血球板法優點：快捷、簡便缺點：不能區分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數；用于單細胞微生物血球計數板法原理：將1cm2×0.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計數其中的細胞數目，換算成單位體積中的細胞數。血球計數板法2）比濁法在一定范圍內，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比。特點：快速、簡便；但易受干擾。2間接法（活菌計數法）

1）2）薄膜過濾計數法測定含菌量較少的空氣和水中的微生物數目。 將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進行培養，然后計算菌落數，可求出樣品中所含菌數。二、重量法總氮測定法測定多細胞及絲狀真菌生長情況的有效方法直接法干重濕重間接法DNA含量測定法三、生理指標測定法樣品中微生物數量多或生長旺盛，這些指標愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等設備來測定相應的指標。常用于對微生物的快速鑒定與檢測微生物的生理指標，如呼吸強度，耗氧量、酶活性、生物熱等與其群體的規模成正相關。第三節微生物的生長規律一、細菌群體生長規律（典型生長曲線）兩個定義生長曲線分批培養分批培養：指微生物在一定容積的培養基中，在特定培養條

件下只完成一個生長循環（最后一次收獲）的培

養方法。（封閉系統）連續培養：指微生物在整個生長時間，以一定的方法（恒濁、

恒化）使微生物持續的以較恒定的生長速率生長

的培養方法。（開放系統）生長曲線：

將少量單細胞的純培養，接種到一恒定容積的液體培養基中，在適宜條件下培養，定時取樣，測菌量。以培養時間為橫坐標，以細菌增長數目的對數為縱坐標，繪制所得的曲線。細菌純培養群體生長測定根據微生物生長速率常數（每小時的分裂代數）的不同，可分為遲緩期，對數期，穩定期和衰亡期。生長曲線可分：延遲期對數期衰亡期穩定期其它名稱：停滯期、調整期現象：曲線平行于橫軸特點：生長速率常數=0形態變大合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快）對不良條件敏感（如氯化鈉、溫度、抗生素等）原因：適應環境，調整代謝1延遲期◆菌種：繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短◆接種物菌齡：用對數生長期的菌種接種時，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期；◆接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發酵工業上一般采用1/10的接種量）；◆培養基成分：

在營養成分豐富的天然培養基上生長的延滯期比在合成培養基上生長時短；

接種后培養基成分有較大變化時，會使延滯期加長，所以發酵工業上盡量使發酵培養基的成分與種子培養基接近。★影響延遲期長短的因素：對實踐的指導意義：◆在發酵工業上需盡量縮短延遲期；①增加接種量；（群體優勢----適應性增強）②采用對數期的菌種；③調整培養基◆在食品工業上，盡量在此期進行消毒或滅菌2對數期其他名稱：指數期現象：細胞數目以幾何級數增加，其對數與時間呈直線關系。特點：生長速率常數最大，即代時最短細胞進行平衡生長（菌體大小、形態、生理特征等比較一致）代謝最旺盛對理化因素較敏感影響因素：菌種；營養成分；營養物濃度﹡培養溫度應用意義：①生產上用作接種的最佳菌齡；②發酵工業上盡量延長該期，以達到較高的菌體密度③食品工業上盡量使有害微生物不能進入此期④是生理研究或進行染色、形態觀察等的良好材料3穩定期又稱：恒定期或最高生長期特點：①生長速率處于動態平衡。②分裂速度下降，開始積累內含物，產芽孢的細菌開始產芽孢。③開始合成次生代謝產物。產生原因：

營養物耗盡營養物比例失調代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）物化條件不合適（pH、氧化還原勢等）應用意義：發酵生產形成的重要時期（抗生素、氨基酸等），生產上應盡量延長此期，提高產量，措施如下：補充營養物質（補料）調pH

調整溫度4衰亡期特點：①出現“負生長”。②細胞內顆粒更明顯，細胞出現畸形或衰退形，芽孢釋放。產生原因：生長條件的進一步惡化，使細胞內的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體的死亡二、同步培養

1.概念同步培養(synchronousculture)：是一種培養方法，它能使群體中不同步的細胞轉變成能同時進行生長或分裂的群體細胞。同步生長：以同步培養方法使群體細胞能處于同一生長階段，并同時進行分裂的生長方式同步培養物常被用來研究在單個細胞上難以研究的生理與遺傳特性和作為工業發酵的種子，它是一種理想的材料。同步培養方法機械方法環境條件控制技術離心方法過濾分離法硝酸纖維素濾膜法溫度培養基成份控制光照和黑暗交替培養硝酸纖維素濾膜法離心法三、連續培養

連續培養(continouscultureofmicroorganisms)是在微生物的整個培養期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續生長下去的一種培養方法。

連續培養的基本原則：微生物培養過程中不斷的補充營養物質和以同樣的速率移出培養物連續培養類型恒濁連續培養恒化連續培養無菌培養基儲備器控制系統培養裝置收集器通氣、攪拌裝置(一)恒化連續培養在整個培養過程中通過控制培養基中某種營養物質的濃度基本恒定（低）的方式，保持細菌的比生長速率恒定，使生長“不斷”進行。生長速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和銨鹽等氮源，或是葡萄糖、麥芽糖等碳源或者是無機鹽，生長因子等物質恒化器連續培養通常用于微生物學的研究工作，如篩選不同的變種、模擬自然條件等。生長限制因子：凡是處于較低濃度范圍內，可影響生長速率和菌體產量的營養物就稱生長限制因子(二)恒濁連續培養通過連續培養裝置中的光電系統控制培養液中菌體濃度恒定、使細菌生長連續進行的一種培養方式。用于菌體以及與菌體生長平行的代謝產物生產的發酵工業(三)連續發酵與單批發酵相比優點：縮短發酵周期，提高設備利用率；便于自動控制；降低動力消耗及體力勞動強度；產品質量較穩定；缺點：雜菌污染和菌種退化第四節環境因素對微生物的影響影響因素：氧溫度PH值影響表現：影響酶活性影響細胞膜的流動性影響物質的溶解度一、溫度（一）微生物生長的三個溫度基點最低生長溫度：微生物生長的最低溫度下限；最高生長溫度：微生物生長的最高溫度；最適生長溫度：微生物生長最快時的溫度1）最適溫度不等于積累代謝產物的最佳溫度；2）同類型發酵使用菌種不同，最適溫度不同；3）同一微生物不同生理活動的最適溫度不同。根據微生物的最適生長溫度的不同，可將微生物劃為三個類型：（二）微生物生長溫度類型低溫型微生物（嗜冷微生物）中溫型微生物（嗜溫微生物）高溫型微生物（嗜熱微生物）

微生物類型

生長溫度／℃最低最適最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035；嗜溫微生物15-2020-4545以上嗜熱微生物4555-6580超嗜熱或嗜高溫微生物6580-90100以上應用

低溫：速凍加保護劑，用于菌種保藏

干熱法

高溫用于消毒滅菌

濕熱法理化因素的影響—溫度微生物對氧的需要和耐受力在不同的類群中變化很大，根據微生物與氧的關系,可把它們分為幾種類群:

專性好氧菌:好氧菌

微好氧菌：兼性厭氧菌耐氧厭氧菌：

厭氧菌

(專性)厭氧菌：二、氧氣氧濃度對不同微生物生長的影響在氧還原為水的過程中，可形成某些有毒的中間產物，例如，過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2·

）等。超氧陰離子為活性氧，兼有分子和離子的性質，反應力極強，極不穩定，可破壞膜和重要生物大分子，對微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解這些產物的酶，如過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等。而嚴格厭氧菌缺乏SOD，故易被生物體內極易產生的超氧陰離子自由基毒害致死。厭氧菌的氧毒害機制——SOD學說：各類菌所含對氧解毒酶

專性好氧菌SOD，過氧化氫酶兼性厭氧菌SOD，過氧化氫酶專性厭氧菌二種酶均無微好氧菌少量SOD耐氧菌SOD，過氧化物酶◆影響膜表面電荷的性質及膜的通透性◆改變酶活、酶促反應的速率及代謝途徑如：酵母菌在pH4.5-5產乙醇，在pH6.5以上產甘油、酸。◆影響培養基中營養物質的離子化程度三、pH（一）影響表現：微生物生長的pH值三基點：各種微生物都有其生長的最低、最適和最高pH值。低于最低、或超過最高生長pH值時，微生物生長受抑制或導致死亡。（二)不同微生物對pH要求不同

微生物最低PH最適PH最高PH細菌3-56.5-7.58-10酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌1-34.5-5.57-8（三）微生物的生命活動對環境pH值的影響★微生物在生長過程中也會使外界環境的pH值發生改變：由于有機物分解：分解糖類、脂肪等，產生酸性物質，使培養液pH值下降；分解蛋白質、尿素等，產生堿性物質，使培養液pH值上升由于無機鹽選擇性吸收：銨鹽吸收（(NH4)2SO4H2SO4），pH↓硝酸鹽吸收(NaNO3NaOH)，pH↑★培養過程中調節pH值的措施過酸時：加入堿或適量氮源，提高通氣量。過堿時：加入酸或適量碳源，降低通氣量。NH4+被吸收NO3+被吸收★配制培養基時調整pH值的措施：第五節微生物生長繁殖的控制一基本概念防腐(antisepsis)：在某些化學物質或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生長的一種措施消毒(disinfection)：利用某種方法殺死或滅活物質或物體中所有病原微生物的一種措施滅菌(sterilization)：指利用某種方法殺死物體中包括芽孢在內的所有微生物的一種措施化療(chemotherapy)：利用具有選擇毒性的化學物質如磺胺、抗生素等對生物體內部被微生物感染的組織成病受細胞進行治療，以殺死組織內的病原微生物或病變細胞，但對機體本身無毒害作用的治療措施。二控制微生物的物理因素

溫度輻射作用過濾滲透壓干燥超聲波（一）溫度★干熱滅菌法（dryheatsterilization）焚燒法（incineration）：是將被滅菌物品在火焰中燃燒，使所有的生物質碳化。簡單、徹底，但對被滅菌物品的破壞極大。適用于無經濟價值的物品滅菌，及不怕燒的實驗器具，如接種環、鑷子、試管或三角瓶口的滅菌等。干燥熱空氣滅菌法(hot-airoven)：將物品放入烘箱內，然后升溫至150℃—170℃，維持1—2小時。適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌，不適合液體樣品，及棉花、紙張、纖維和橡膠類物質的滅菌。特點：由于空氣傳熱穿透力差，菌體在脫水狀態下不易殺死，所以溫度高、時間長。

★濕熱法(moistheatsterilization)

：特點：溫度低、時間短、滅菌效果高原因：

1)菌體內含水量越高，則凝固溫度越低；

2)蒸汽冷凝會放出潛熱；

3)飽和水蒸汽穿透力強；

4)濕熱易破壞細胞內蛋白質大分子的穩定

性，主要破壞氫鍵結構。高壓蒸汽滅菌法利用水的沸點隨水蒸氣壓力的增加而上升，以達到100℃以上高溫滅菌的方法。方法：121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2）維持15-20min。

112℃（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。

115℃（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。應根據滅菌物品的性質或成分選擇滅菌溫度例如：生理鹽水、營養瓊脂等培養基用121℃。含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培養基用112℃。適用：耐高溫物品，玻璃儀器、含水或不含水的物品。高壓蒸汽滅菌鍋注意事項：排凈冷空氣；滅菌終了，緩慢降壓；滅菌結束，趁熱取出物品。高溫對培養基的影響及其防止措施高溫對培養基的不利影響：▲會產生混濁或形成不溶性沉淀▲營養成分被破壞（PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）；▲色澤加深（褐變如產生氨基糖等）；▲改變培養基的pH值（通常下降0.2）；▲形成有害物質，抑制微生物生長；消除有害影響的措施采用特殊的加熱滅菌法過濾除菌法加入螯合劑煮沸消毒法將水加熱至100℃，煮沸15min—30min，可殺死所有營養細胞和部分芽孢，達到消毒物的目的。巴斯德消毒法（Pasteurization）：用較低的溫度來殺死其中的病源微生物，這樣既保持食品的營養風味，又進行了消毒該法一般是將待消毒的液體食品置于62℃處理30min，然后迅速冷卻。即可達到消毒目的。低溫長時法(Lowtemperaturelongtime,LTLT)；62.9℃30min處理牛奶高溫瞬時法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.6℃15s處理牛奶超高溫巴斯德滅菌法(Ultrapasteurization):讓液體食品停留在140℃左右3-4s，急劇冷卻至75℃，經勻質化后冷卻至20℃。間歇滅菌法：

將待滅菌物品在80-100℃蒸煮15-60min，冷卻后擱置室溫（28-37℃）下過夜，并重復以上過程三遍以上。其蒸煮過程可殺死微生物的營養體，但不能殺死芽胞，室溫過夜促使殘留的芽孢萌發成營養體，再經蒸煮過程可殺死新的營養體；循環三次以上可保證徹底滅菌的目的。適用于不耐高溫的物品滅菌，如不適于高壓滅菌的特殊培養基、藥品的滅菌。缺點是麻煩、費時。低溫——低溫是通過降低酶反應速度使微生物生長受到抑制。冷藏法：5℃，微生物斜面菌種放置冷藏箱中可保存數周至數月而不衰竭死亡；食品保鮮冷凍法：食品工業中采用-10℃左右的冷凍溫度較長時間地保藏食品；冷凍法也可用作菌種保藏，但所需溫度更低，如-80℃低溫冰箱、或-78℃干冰、或-80℃液氮中冷凍保存。2、低溫抑菌（二）輻射作用(radiationSterilization)輻射滅菌是利用電磁輻射產生的電磁波殺死大多數物質上的微生物的一種有效力法。電磁波:微波:通過熱產生殺死微生物的作用；紫外線(UV):使DNA分子中相鄰的嘧啶形成嘧啶二聚體，抑制DNA復制與轉錄等功能，殺死微生物；X射線和y射線:使其他物質氧化或產生自由基(OH·、H·)破壞和改變生物大分子的結構，以抑制或殺死微生物。3．過濾作用不耐熱的液體培養基的滅菌采用濾孔比細菌還小的篩子或濾膜作成各種過濾器，當空氣或液體流經篩子或濾膜時，微生物不能通過濾孔而被阻留在一側，從而達到滅菌的目的。但不能除去病毒。實驗室中常用的濾器：濾膜過濾器、蔡氏過濾器、玻璃過濾器、磁土過濾器等。過濾介質：醋酸纖維素膜、硝酸纖維素膜、聚丙烯膜；以及石棉板、燒結陶瓷、燒結玻璃等。濾器孔徑：常用0.22μm

、0.45μm

。應用：對于含酶、血清、維生素和氨基酸等熱敏物質除菌。細胞內溶質濃度與胞外溶液的溶質濃度相等時，為等滲溶液,溶液的溶質濃度高于胞內溶質濃度為高滲溶液,溶液的溶質濃度低于胞內溶質濃度為低滲溶液.在等滲溶液中,微生物的活動保持正常,細胞外形不變在高滲溶液中,細胞易失水,脫水后發生質壁分離,生長受抑制或死亡.(鹽漬和糖漬保藏食品)在低滲溶液中,細胞吸水膨脹,甚至導致細胞破裂死亡.4.滲透壓滲透壓和干燥都涉及到水分含量和水活度，它們對微生物的生長都有很大的影響。干燥對微生物的影響干燥抑制微生物生長或造成其死亡的原因：干燥能引起微生物細胞內蛋白質的變性和鹽類等物質濃度提高，從而抑制生長或造成微生物死亡5.干燥三、控制微生物的化學物質

1．抗微生物劑

抗微生物劑(antimicrobialagcnt)是一類能夠殺死微生物或抑制微生物生長的化學物質根據它們抗微生物的特性可分為：

抑菌劑

殺菌劑

溶菌劑

用機理是這類物質結合到核糖體上抑制蛋白質合成，導致生長停止，由于它們同核糖體結合不緊，它們在濃度降低時又會游離出來，核糖體合成蛋白質的能力恢復，使生長恢復它們是緊緊地結合到細胞的作用靶上，即使在濃度降低時也不能游離出來，因此生長不能恢復能抑制細胞壁合成或損傷細胞質膜抗微生物劑通常又將它們分為消毒劑：可殺死微生物，通常用于非生物材料的滅菌或消毒。防腐劑：能殺死微生物或抑制其生長，但對人及動物的體表組織無毒性或毒性低，可作為外用抗微生物藥物。HgCl2、CuSO4、碘液、氯氣、乙烯氧化物、甲醛劑、臭氧有機汞、0.1%-1％硝酸銀、碘液、70%乙醇、3％過氧化氫類型名稱及使用方法作用原理應用范圍醇類70%—75%乙醇脫水、蛋白質變性皮膚、器皿醛類0.5%—10%甲醛2%戊二醛（pH=8）蛋白質變性房間、物品消毒（不適合食品廠）酚類3%—5%石炭酸2%來蘇兒3%—5%來蘇兒破壞細胞膜、蛋白質變性地面、器具皮膚地面、器具氧化劑0.1%高錳酸鉀3%過氧化氫0.2%—0.5%過氧乙酸氧化蛋白質活性基團，酶失活皮膚、水果、蔬菜皮膚、物品表面水果、蔬菜、塑料等常用的消毒防腐劑及其應用

常用的消毒防腐劑及其應用類型名稱及使用方法作用原理應用范圍重金屬鹽類0.05%—0.1%升汞2%紅汞0.1%—1%硝酸銀0.1%—0.5%硫酸銅蛋白質變性、酶失活變性、沉淀蛋白蛋白質變性、酶失活非金屬器皿皮膚、粘膜、傷口皮膚、新生兒眼睛防治植物病害表面活性劑0.05%—0.1%新潔爾滅0.05%—0.1%杜滅芬蛋白變性、破壞細胞膜皮膚、粘膜、器械皮膚、金屬、棉織品、塑料常用的消毒防腐劑及其應用類型名稱及使用方法作用原理應用范圍鹵素及其化合物0.2—0.5mg/L氯氣10%—20%漂白粉0.5%—1%漂白粉2.5%碘酒破壞細胞膜、蛋白質飲水、游泳池水地面水、空氣等皮膚染料2%—4%龍膽紫與蛋白質的羧基結合皮膚、傷口酸類

0.1%苯甲酸

0.1%山梨酸食品防腐食品防腐各種抗微生物化學制劑殺菌能力的比較標準：石炭酸系數：指在一定時間內被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度和達到同效的石炭酸的最高稀釋度的比率。一般規定處理時間為10分鐘，而供試菌定為Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）。在臨床上最早使用的消毒劑----石炭酸概念：化學治療劑是指那些能夠特異性地作用于某些微生物并具有選擇毒性的化學藥劑，它們與非特異的化學藥劑相比對人體幾乎沒有什么毒性或毒性很小，可用作治療微生物引起的疾病。既適用于涂抹肌體表面，也始于通過口服或注射吸收到體內。種類：

抗代謝藥物——人工合成的

抗生素——微生物所產生的化學治療劑2．抗代謝物

(Antimetabolite)有些化合物在結構上與生物體所必需的代謝物很相似，以至可以和特定的酶結合，從而阻礙了酶的功能，干擾了代謝的正常進行，這些物