模塊二：相關的分離純化技術

子模塊一：原料的預處理技術復習提問簡述糖酵解的意義？1mol葡萄糖徹底氧化生成多少ATP？新課導入我們如何從生物體中提取出生物活性大分子？生物技術下游加工過程的一般流程和單元操作培養液（發酵液）的預處理和固液分離；初步純化（提取）；高度純化（精制）；成品加工。一般下游加工過程可分為4個階段

下游加工過程的一般流程（沉淀、吸附、萃取、超濾、結晶）發酵液初步純化細胞碎片分離細胞破碎細胞分離高度純化成品加工預處理胞外產物（加熱、調pH、絮凝）（過濾、離心分離、膜分離)（勻漿、研磨、酶解）（離心分離、雙水相萃取、膜分離）（重結晶、離子交換、色譜分離、膜分離）（濃縮、無菌過濾、干燥、成型）胞外產物提取精制——產品的收得率和質量控制。影響其純化的因素是什么？影響發酵液后處理的主要因素粘度,雜蛋白影響樹脂對產物的吸附能力；在萃取操作中，易產生乳化，不利于兩相的分離；污染濾膜，降低濾速高價無機離子當采用離子交換法提取產物時，影響樹脂對生化物質的交換容量降低發酵液粘度去除雜蛋白目的不僅在于分離細胞、菌體和其它懸浮顆粒（細胞碎片、核酸和蛋白質的沉淀物），還希望除去部分可溶性雜質和改變濾液的性質，以利于后繼各步操作。采用絮凝或凝聚的方法，設法增大懸浮液中固體粒子的大小，提高其沉降速度；或采用稀釋、加熱等方法降低黏度，以利于過濾。發酵液的預處理一、發酵液過濾特性的改變微生物發酵液的特性為：發酵產物濃度較低，大多為1-10%，懸浮液中大部分是水；懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；固體粒子可壓縮性大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體；性質不穩定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。微生物發酵液的成分極為復雜，其中除了所培養的微生物菌體及殘存的固體培養基外，還有未被微生物完全利用的糖類、無機鹽、蛋白質，以及微生物的各種代謝產物。改善發酵液過濾特性的物理化學方法：調酸（等電點）、熱處理、電解質處理、添加凝聚劑、添加表面活性物質、添加反應劑、冷凍-解凍及添加助濾劑等。1.降低液體粘度

2.調整pH3.凝聚與絮凝

根據流體力學原理，濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度（加水稀釋法和加熱法等）可有效提高過濾速率。注意加熱溫度與時間，不影響產物活性和細胞的完整性。pH值直接影響發酵液中某些物質的電離度和電荷性質，適當調節pH值可改善其過濾特性。氨基酸、蛋白質等電點的調節；在膜過濾中，發酵液中的大分子物質易與膜發生吸附，通過調整pH值改變易吸附分子的電荷性質，即可減少堵塞和污染；細胞、細胞碎片及某些膠體物質等在某個pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進行。采用凝聚和絮凝技術能有效改變細胞、細胞碎片及溶解大分子物質的分散狀態，使其聚結成較大的顆粒，便于提高過濾速率。另外，還能有效地除去雜蛋白和固體雜質，提高濾液質量。凝聚——指在電解質作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩定的現象；絮凝——指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團的過程。陽離子對帶負電荷的膠粒凝聚能力的次序為：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用的凝聚劑電解質有：硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O（明礬）；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3（1）凝聚

發酵液中的細胞、菌體或蛋白質等膠體粒子雙電層的結構使膠粒之間不易聚集而保持穩定的分散狀態。

絮凝定義：是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使細胞聚集形成粗大的絮凝團的過程。1）有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2）無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；3）天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。目前最常見的高分子聚合物絮凝劑有機合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）類衍生物根據活性基團在水中解離情況不同，可分為三類：非離子型、陰離子型（含有羧基）陽離子型（含有胺基）工業上使用的絮凝劑可分為三類：聚丙烯酰胺類絮凝劑的優點用量少，一般以mg/L計量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫藥工業時應謹慎。聚丙烯酰胺類絮凝劑的應用醫藥和食品工業：聚丙烯酸類陰離子絮凝劑（無毒），聚苯乙烯類衍生物，無機高分子聚合物絮凝劑（聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等），天然有機高分子絮凝劑（多聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等）。聚丙烯酰胺絮凝劑對于帶負電荷的菌體或蛋白質來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產生吸附橋架的雙重機理；對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。（3）混凝4.加入助濾劑5.加入反應劑

一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。懸浮液中大量的細微膠體粒子被吸附到助濾劑的表面上，改變了濾餅結構，降低了過濾阻力。常用的助濾劑有：硅藻土、纖維素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。使用硅藻土時，通常細粒用量為500g/m3；中等粒度用量為700g/m3；粗粒用量為700-1000g/m3。加入反應劑和某些可溶性鹽類發生反應生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結，使菌絲具有塊狀結構，沉淀本身可作為助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固，改善過濾性能；如發酵液中含有不溶性多糖物質，用酶將其轉化為單糖，以提高過濾速率。如萬古霉素用淀粉作培養基，發酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過濾效率5倍。發酵液中的雜質高價無機離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）雜蛋白在采用離子交換提煉時，會影響樹脂對生化物質的交換容量。在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力，在有機溶劑法或雙水相萃取時，易產生乳化現象，使兩相分離不清。在常規過濾或膜過濾時，易使過濾介質堵塞或受污染，影響過濾效率。

因此，在預處理時，應盡量除去這些物質。二、發酵液的相對純化（一）、高價無機離子的去除方法Ca2+——草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）

；Mg2+——三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡合物；Fe2+——黃血鹽，→普魯士蘭沉淀（二）雜蛋白的去除方法蛋白質一般以膠體狀態存在于發酵液中。在酸性溶液中帶正電荷；在堿性溶液中帶負電荷。在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點。1.沉淀法在酸性溶液中，蛋白質與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，蛋白質與一些陽離子，如Ag+、Cu++、Zn++、Fe+++和Pb++等形成沉淀。A.酸堿調節，使蛋白質與鹽或離子形成沉淀。2.變性法

加熱，大幅度調節pH值，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。不足之處加熱法只適合于對熱較穩定的目的產物；極端pH值也會導致某些目的產物失活，且要消耗大量酸堿；有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數量較少的場合。加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質而除去。在四環素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質；在枯草桿菌發酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法重力沉降浮選旋液分離介質過濾離心通氣，產生氣泡，使固體附著在氣泡表面除去。用于固液比重差小、直徑5～30μm顆粒的分離，污水處理懸浮液以較高速度沿切線方向進入旋風分離器，輕相由分離器中央排出，重相由分離器下部排出，但不適合直徑<5μm顆粒去除（可用絲網分離器）。工業上常用霉菌和放線菌為絲狀菌，體形較大，發酵液采用過濾方法；細菌和酵母菌為單細胞，體形較小，其發酵液采用高速離心分離，如對發酵液進行預處理，也可用過濾進行固液分離。二、固液分離的方法優點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點：設備投資高、能耗大。離心機種類：碟片式離心機、管式離心機、傾析式離心機。1.離心分離在液相非均一系統中，利用離心力達到液－液、液－固、液－液－固分離的方法，統稱為離心分離。離心分離因數f=Gu2gRGgR(2πRn)260GRn2900===GDn21800重量kg旋轉直徑轉速r/min微生物發酵液中含有大量菌體、細胞或細胞碎片以及殘余的固體培養基成分。過濾就是將懸浮在發酵液中的固體顆粒與液體進行分離的過程。在過濾操作中，要求濾速快、濾液澄清，并且有高的收率。2.過濾A.根據過濾機理，過濾操作可分為澄清過濾和濾餅過濾。澄清過濾：濾餅過濾：過濾介質為硅藻土、砂、顆粒活性炭、玻璃珠、塑料顆粒等，當懸浮液通過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，適合于固體含量少于0.1g/100ml、顆粒直徑在5-100um的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。過濾介質為濾布，包括天然或合成纖維織布、金屬織布、玻璃纖維紙、合成纖維等無紡布。當懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（濾渣）。當濾餅至一定厚度時即起過濾作用，此時即可獲得澄清的濾液，這種方法叫做濾餅過濾，在濾餅過濾中，懸浮液本身形成的濾餅起著主要的過濾作用，適合于固體含量大于0.1g/100ml的懸浮液的過濾分離。B.常用過濾設備（1）板框壓濾機優點過濾面積大，結構簡單，價格低，動力消耗少，對不同過濾特性的發酵液適應性強。缺點不能連續操作，設備笨重，勞動強度大，衛生條件差，非過濾的輔助時間較長。廣泛應用于培養基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。單元組成板布板布板操作注意點盡量使工作時間和輔助時間接近；降低濾液粘度（2）真空轉鼓過濾機（3）硅藻土過濾機（3）硅藻土過濾機1）切向流過濾（Cross-FlowFiltration）又稱錯流過濾

交叉過濾和十字流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術。其操作特點是使懸浮液在過濾介質表面作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質表面的固體（濾餅）移走。2）雙水相萃取

向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度