分子生物學與生物化學實驗

操作、設計與技能PCR實驗中常見問題及解決辦法李剛副教授標準的PCR反應體系

10×擴增緩沖液10μl

4種dNTP混合物各200μmol/L

引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5Unit

Mg2+

1.5mmol/L

加三蒸水或超純水至50μl。

PCR產物的電泳檢測時間

一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚至消失。

PCR反應有哪些關鍵環節？

①模板核酸的制備；②引物的質量與特異性；③酶的質量；④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板最容易出現的問題一、模板含有雜質：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定,不宜隨意更改。

二、模板發生變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。通常模板發生變異的主要原因是模板切膠回收時間過長（一般應控制在1分鐘以內）或無意中將模板置于超凈工作臺中滅菌所致。

PCR引物常見的問題引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

DNA聚合酶的問題酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR失敗是由于忘加了酶。

Mg2+濃度Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。對于一些難以擴增的模板，建議買PCRBuffer中Mg2+free的PCR試劑，以便自己通過一些預實驗找出PCR反應中最佳的Mg2+濃度。

PCR反應體積通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。如果不愿重新摸索條件，一個最簡單可行的辦法是按照小體積的條件多做幾管，最后將PCR產物匯集在一起。

退火溫度對PCR的影響退火溫度對PCR的擴增來說相當重要，如退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。退火溫度可以用引物的Tm值-5度來粗略估計。但是精確的退火溫度必須通過預實驗來確定（可以使用梯度PCR儀）。有時還有必要用標準的溫度計（多用電子溫度計，帶有金屬傳感器探針）檢測一下擴增儀內的溫度控制是否準確，這也是PCR失敗的原因之一。

PCR出現假陽性的原因？

假陽性：出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。出現假陽性的原因主要有：

（1）引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

（2）靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，這種污染可以通過更換實驗場地來解決，有時也可用巢式PCR方法來減輕或消除。

非特異性擴增帶出現的原因

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。

非特異性擴增帶出現的對策（一）其對策有：必要時重新設計引物；減低酶量或調換另一來源的酶；降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數；適當提高退火溫度或采用二溫度點法(98℃變性，68℃左右退火與延伸.如TaKaRa公司的PrimeSTARHSDNAPolymerase就是采用的二溫度點法)。

非特異性擴增帶出現的對策（二）采用熱啟動PCR：把PCR混合物在顯著低于Tm值的溫度下作哪怕短暫的保溫，也可能產生引物二聚體和非特異性配對。熱啟動PCR則可以大大減少這些麻煩。其目標是在第一個循環中等溫度升到超過反應物的Tm值后才允許反應中的一兩種關鍵成分進入反應。例如在復蓋有礦物油的小試驗中，所有反應管的一種公共成分（如Taq酶）可以先不加，而到第一個循環的變性階段溫度超過80℃以后再加。最近有一種熱啟動的方法是在加入TaqDNA聚合酶前先在管中加入其單克隆抗體（Clonetech公司的TaqStartAntibody，或者ToYoBo公司的KodPlusDNA聚合酶），在溫度升高到將中和抗體變性失活之前，抗體阻遏聚合酶的活性，防止反應開始。非特異性擴增帶出現的對策（三）嵌套式和半嵌套式PCR對于減少或消除不需要的產物同時提高靈敏度經常是很成功的。首先在常規條件下用第一套跨越目的DNA片段的引物擴增，假象產物經常會與引物中的一條或兩條配對，但其內部卻是無關序列。接著對一部分反應物－產物混合物進行新一輪擴增，采用的引物與第一對引物內側的序列配對，在這一輪擴增中只有真正的產物被擴增。這種辦法即使在目的產物開始用EB染色檢測不到而且有假象帶時也常常獲得成功。半嵌套式PCR，只第二條引物在目的片段一端的內側，也同樣有效。在基因步行或企圖進行5‘或3’端RACE時，由于只有一條引物內部的序列是已知的，經常需要作這種變動。采用嵌套式PCR方法，第一、二輪擴增在第20個循環左右終止而不是象通常的在第30－35個循環終止會獲得更好的結果，這樣做減少了產生不需要的高分子量帶和成片產物的機會。嵌套式PCR極端敏感，在106基因組DNA背景中一個拷貝的病毒基因也能檢測到。第二種形式的假象，即所謂的跳躍PCR，可能不能用嵌套式PCR消除。一些延伸不完全的產物可能偶爾與相鄰的DNA片段，也許是相似的基因成分重新配對，這樣會產生不需要的產物。在這種情況下，一條或兩條引物內側的序列仍舊存在，但擴增產物的大小不同。出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶；減少dNTP的濃度；適當降低Mg2+濃度；增加模板量，減少循環次數。

克隆PCR產物的最優條件是什么？

最佳插入片段：載體（常用T載體）比例需實驗確定。1：1（插入片段：載體）是最常采用的比例。連接反應通常室溫下保溫1小時即可，如有必要，也可4℃（16℃）過夜。在這2種溫度下，無插入片段的載體會自連，產生藍斑。而帶有插入片段的載體則產生白斑。使用TA克隆方法或平端連接方法（采用高保真DNA聚合酶如Pfu擴增的PCR產物為平末端，此時可利用pUC19載體上的SmaI位點連接PCR產物或采用平端的PCR產物克隆載體）。

PCR產物是否需要用凝膠純化？

如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體或其它非特異性條帶。為此需在克隆前做凝膠純化（即切膠回收目的條帶）。

PCR出現smear可能的原因（1）

Smear，也稱彌散帶、片狀拖帶或涂抹帶。都是由于產生非特異性擴增所致，需要逐個驗證：

1、酶、dNTP、引物、模板濃度太大?？梢詼p少這幾個組分的用量。

2、退火溫度太低。需要升高退火溫度，可以先做一個不同溫度的預實驗或者選用降落PCR。

3、引物特異性不好。引物特異性的好壞可以通過引物設計軟件分析，也可以在ncbi比對得知。關于引物是否合成的好，可以電泳看一下。如果只有一條清晰的帶就可以了。如果合成的不好，產物自然不特異了，就很容易產生smear。

4、Mg2+濃度的問題。這個成分對產物的特異性是非常重要的，可以做一個梯度實驗優化一下。

PCR出現Smear的可能原因（2）假定使用了比較好的Taq酶，且引物沒有出現問題，可再考慮如下幾點：

1、模板是否過量？

2、退火溫度是否可升高1－2度？

3、Mg2＋的濃度是否控制在1.5mM左右?

4、循環數是否過多？

進行多輪PCR時，PCR產物

成片的原因?進行多輪PCR時，如果下一輪PCR反應的起始模板量太大，即使PCR條件是正常的，產物成片現象也可能會出現?？偟囊巹t是如果上一輪PCR產物在凝膠上見得到條帶，只能用1l上一輪PCR產物的1：104到1：105稀釋物作為模板進行下一輪PCR。另外對上一輪PCR產物稀釋也降低了下一輪PCR產物出錯的概率。很少或沒有檢測到產物的原因如果已經調整了Mg2＋濃度、緩沖液的pH值和循環產物，而且也增加了循環數，嘗試過了較低的退化溫度和TDPCR，但在EB染色的凝膠上還是看不到產物（聚丙烯酰胺凝膠比瓊脂糖凝膠要敏感一些），而陽性對照表明試劑沒有問題，下一步該怎么辦？延長起始的變性時間和（或）提高溫度能增加模板DNA完全變性的可能，以提供最大數量的引物配對位點。這一可選步驟的標準條件是95C變性5分鐘，有可能擴增發生了，只是效率不高，如果這樣，可通過對干凝膠或印跡的雜交來檢測產物。用同一套引物或者最好用嵌套式引物進行第二次擴增，有可能得到特異產物，這時必須用第一次PCR產物的從1：100到1：10000的一系列10倍稀釋物。很少或沒有產物可能提示DNA樣品中存在抑制物。許多PCR的抑制物已被描述過，它們包括離子性去污劑（如SDS）、酚、肝素等。通過