日常維護和常見色譜故障Page2711溶劑準備：過濾防止固體顆粒損傷儀器或柱頭使用小于0.5

m過濾膜.有機物-Teflon水

-Nylon66使用HPLC純溶劑過濾裝置真空2溶劑過濾不干凈的溶劑或在溶劑瓶中長菌的溶劑會阻塞溶劑過濾器，降低泵的操作性能。遵從下列建議可以提高性能，延長溶劑過濾器的壽命：使用無菌溶劑瓶避免溶劑長菌。用濾膜過濾溶劑去除微生物。每兩天更換或過濾溶劑。避免溶劑瓶直接日照。3溶劑信息避免使用下列對不銹鋼有腐蝕性的溶劑：鹵化物堿金屬溶液和相應的酸溶液。高濃度的無機酸例如：硝酸和硫酸。能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。含有過氧化物的色譜級醚必須用氧化鋁干燥劑。在有機溶劑中的有機酸溶液。含有強絡合劑的溶液。四氯化碳和異丙醇或THF混合液。4NameAceticAcidAcetoneAcetonitrileBenzeneButylAlcoholCarbonTetrachlorideChloroformCyclohexaneCyclopentaneDichloroethaneDichloromethaneDimethylformamideDimethylSulfoxideDioxanEthylacetateEthylAlcoholDi-EthyletherHeptaneHexaneMethylAlcoholMethylethylKetoneI-OctanePentaneI-PropylAlcoholTetrachloroethaneTetrahydrofuranTolueneAceticAcidAcetoneAcetonitrileBenzeneCarbonTetChloroformCyclopentaneButylAlcoholCyclohexaneDichloroethaneCHCl22DMFDMSODioxanEthylacetateEthylAlcoholDi-EthyletherHeptaneHexaneMethylAlcoholMEKI-OctanePentaneI-PropylAlcoholDi-PropyletherCH22Cl4THFTolueneTrichloroethaneWaterXyleneTrichloroethaneWaterXyleneDi-PropyletherImmiscibleMiscible溶劑的相溶性5溶劑的紫外吸收SolventUVCutoff(nm)Acetonitrile190WaterCyclohexane195Hexane200Methanol210Ethanol210DiethylEther220Dichloromethane220Chloroform190240CarbonTetrachloride265Tetrahydrofuran280(210)Toluene280UVCutoffisthewavelengthatwhichabsorbanceequals1AU.6溶劑脫氣目的脫氣方法He脫氣排除溶解在流動相中的氧氣和氮氣回流加熱脫氣真空脫氣超聲脫氣7準備流動相流動相應該：HPLC級過濾(最大0.45um,0.2um最好)脫氣，尤其在低流速時相溶8初始化HPLC泵移走溶劑與系統中的氣泡使溶劑組成變化更容易確保分析結果再現性對于反相柱使用5～10倍柱體積流動相平衡色譜柱Flow柱平衡初始化和平衡9預柱和保護柱從泵來的流動相預柱進樣口保護柱分析柱至檢測器預柱是針對流動相來保護色譜柱

保護柱是針對樣品來保護色譜柱10ColumnInstallation柱安裝Eachcolumnhasadefinedflowdirection!Theflowdirectionisshownbythearrowordirectionofwriting.Don’tchangetheflowdirection,thiswilldecreasecolumnperformance.每根柱子都定義一個流動方向.這個流動方向用箭頭或其他方式顯示在柱子上.不要改變隨意改變流動方向,這將降低柱性能.11ColumnInstallationWhat’sneeded:Therightconnectorstoavoidanyfutureleak.GuardcolumntoprotectthemaincolumnTherighttools12ColumnInstallationcont.Practicalhints:Fingertighten1/4turnwithwrench13色譜柱保護過濾所有的溶劑和樣品使用保護柱儀器在使用完畢，要沖洗整個系統，移走系統中緩沖液柱子在不使用時，兩端密封保存在適當的溶劑中保存柱子注意色譜柱的pH值使用范圍不要高壓沖洗柱子不要高溫下過長時間使用硅膠鍵合相14樣品準備樣品完全溶解在流動相中樣品沒有完全溶解過濾樣品，確保樣品中不含固體顆粒用流動相或比流動相弱的溶劑溶解樣品進樣量盡量小15HPLC柱測試對于一根新柱子，在流動相組成不變的情況下進行下述實驗并記錄：1.記錄理論塔板數N，以及:柱子長度及內徑.測試樣品名稱及K’值.固定相和流動相.流動相流速.進樣量.溫度.2.峰對稱性包括苯酚胺3.記錄柱子壓力.16TheGoodUser下列優良/常規實驗操作能夠最大限度降低維修費用：清潔的儀器,流動相和樣品;如果必要,進行過濾。保證溶劑的相溶性。儀器使用完畢，沖洗整個系統，去掉鹽份，防止污染。對儀器的維護和保養進行記錄。17混合問題問題：一個有紫外吸收的流動相與一個沒有紫外吸收的流動相動態混合產生噪音，增加靜態混合器可以降低這種噪音。缺點:

增加了死體積++靜態混合器18基線噪音可能的原因：檢測池臟檢測器氘燈能量下降由泵引起的脈沖檢測器上的溫度效應檢測池中有氣泡通過Time(min.)19基線噪音

停泵

噪音是否依然存在是否檢測器?泵或流動相?

其它要考慮的問題▲是否改變了流動相的組成？▲是否改變了檢測波長?▲在你的儀器上使用的最后的流動相是什么?▲流動相是否相溶?▲流動相是否干凈?20基線漂移梯度洗脫引起的溫度不穩定（RID）流動相臟柱子沒有用流動相平衡系統中污染物溢出21鬼峰20%-100%MeOH梯度洗脫沒有進樣鬼峰－沒有進樣就有色譜峰出現。原因－流動相臟60153015037151722柱外擴展用較短的、窄內徑的毛細管連接進樣器和色譜柱以及柱子和檢測器。確認連接管的接頭都相互匹配。使用死體積小的流動池減小進樣量增加柱外死體積23峰形柱頭塌陷或柱床運動。泵頭過濾芯(Frit)部分堵塞。組份共流出1·雙峰正常雙峰柱頭塌陷24峰形2·峰擴展所有峰都擴展柱效降低或有柱塌陷進樣體積過大流動相粘度大部分峰擴展前一次分析樣品的流出物高分子量樣品－蛋白質或聚合物25峰形原因：部分峰拖尾正常拖尾正常拖尾二次保留效應殘留硅醇的相互作用小峰在大峰后洗脫出來3·拖尾對稱因子>1.2柱頭有污染物堆積重金屬反應所有峰均拖尾柱外效應柱子失效26峰對稱ABS=BAExcellentS=1.0-1.05AcceptableS=1.2UnacceptableS=2AwfulS=427拖尾因子t=A+B2AABExcellentt=1.0-1.05Acceptablet=1.2Unacceptablet=2Awfult=428峰形原因：正常前伸柱子過載4·前伸峰小峰在大峰之前洗脫出來對稱因子<0.929峰形原因正常負峰樣品吸收比流動相吸收小。5·負峰溶解樣品的溶劑通過柱子時平衡被破壞RID中最常見30六通閥手動進樣閥-六通閥ToWasteSampleLoop(FixedVolume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFromPumpToWasteCommonProblemsImpropersyringesizeortypeValveBlockageInjection-portleakageSamplecarryoverCross-portleaks31壓力問題

壓力問題壓力過高壓力過低壓力波動???32壓力過高

柱子進口過濾芯被污染PURGE閥過濾芯被污染

色譜柱被污染

連接管路，尤其是針座毛細管堵塞

進樣器旋轉密封閥被堵塞

進樣針或針座被阻塞

壓力測量使用此閥分割系統33監測高壓34溶劑進口過濾芯堵塞連接管路泄漏或其它備件（泵密封