第一節概述第二節固定化酶的性質及其影響因素第三節固定化酶的制備第四節固定化細胞第五節固定化輔酶和原生質體第六節酶反應器和固定化酶（細胞）的應用內容提要第一頁，共九十一頁。生物催化劑細胞酶非生長生長可溶固定化懸浮固定化連續間歇吸附包埋交聯化學連續材料膜固定酶液凝膠吸附化學連接物固定化再循環系統凝膠吸附連續半連續分批間歇連續活塞模式攪拌連續反應器間歇連續活塞模式攪拌連續反應器圖6-1生物催化劑作用方式示意第二頁，共九十一頁。第一節概述游離酶的缺點：1.酶的穩定性較差，在溫度、pH、和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活。2.酶一般都是在水溶液中與底物反應，反應結束后酶難以回收。3.反應結束后，酶成為產物的雜質。第三頁，共九十一頁。固定化酶：固定化酶是指固定在載體上并在一定的空間范圍內進行催化反應的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增強穩定性，可反復或連續使用以及易于和反應產物分開等顯著特點。直接固定菌體或菌體碎片的，稱為固定化菌體或固定化死細胞。第四頁，共九十一頁。水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術第五頁，共九十一頁。固定化酶的優缺點多次使用可以裝塔連續反應優點：純化簡單提高產物質量應用范圍廣缺點：首次投入成本高大分子底物較困難第六頁，共九十一頁。第二節固定化酶的制備一、一般方法及特點二、酶的固定化方法第七頁，共九十一頁。一、選擇方法依據：（1）酶的性質（2）載體的性質（3）制備方法的選擇第八頁，共九十一頁。二、酶的固定化方法（一）吸附法（二）結合法（三）交聯法（四）包埋法第九頁，共九十一頁。（一）吸附法1.物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。

選擇載體的原則：（1）要有巨大的比表面積（2）要有活潑的表面（3）便于裝柱進行連續反應。第十頁，共九十一頁。常用載體：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石優點：缺點：結合力不勞、容易脫落。吸附法常用的載體及優、缺點操作簡單、條件溫和、載體廉價易得、可反復使用。第十一頁，共九十一頁。（二）結合法離子鍵結合法共價鍵結合法定義：選擇適宜載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法稱為結合法。第十二頁，共九十一頁。1.離子鍵結合法概念：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法。常用載體:DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強度、溫度++++++++++++----------------++++++++第十三頁，共九十一頁。2.共價鍵結合法概念：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法。可以形成共價鍵的基團：游離氨基，游離羧基，巰基，咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚基，二硫鍵常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體第十四頁，共九十一頁。共價鍵結合法制備固定化酶的“通式”首先載體上引進活潑基團然后活化該活潑基團最后此活潑基團再與酶分子上某一基團形成共價鍵第十五頁，共九十一頁。載體活化的方法A．重氮法B．疊氮法C．烷基化反應法D．硅烷化法E．溴化氰法第十六頁，共九十一頁。A．重氮法反應式：第十七頁，共九十一頁。目前在我們國內用的較多的載體：該方法需要載體具有芳香族氨基氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素瓊脂糖葡聚糖凝膠瓊脂……第十八頁，共九十一頁。反應式及原理第十九頁，共九十一頁。B疊氮法例：用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶步驟如下：酯化肼解疊氮化偶聯第二十頁，共九十一頁。C．烷基化反應法含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進行活化，形成含有鹵素基團的活化載體。第二十一頁，共九十一頁。D．硅烷化法載體特點：①機械強度好，表面積大。②耐有機溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。第二十二頁，共九十一頁。第二十三頁，共九十一頁。第二十四頁，共九十一頁。第二十五頁，共九十一頁。E．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖類物質。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數（大孔網狀結構）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。第二十六頁，共九十一頁。第二十七頁，共九十一頁。（三）交聯法定義：借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，制成網狀結構的固定化酶的方法稱為交聯法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。第二十八頁，共九十一頁。1.交聯法常用試劑戊二醛己二胺順丁烯二酸酐雙偶氮苯4,4ˊ-雙(二甲氨基)偶氮苯第二十九頁，共九十一頁。2.交聯法的形式交聯法有2種形式：酶直接交聯法酶輔助蛋白交聯法第三十頁，共九十一頁。酶直接交聯法：在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強度、溫度和反應時間之間的平衡。EEEEEE第三十一頁，共九十一頁。酶輔助蛋白交聯法：為避免分子內交聯和在交聯過程中因化學修飾而引起酶失活，可使用第二個"載體"蛋白質（即輔助蛋白質，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質濃度，使酶與惰性蛋白質共交聯。EEE第三十二頁，共九十一頁。（四）包埋法定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。瓊脂瓊脂糖海藻酸鈉角叉菜膠明膠聚丙烯酰胺……載體：第三十三頁，共九十一頁。1．網格型定義：將酶或含酶菌體包埋在凝膠細微網格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。第三十四頁，共九十一頁。2．微囊型包埋法定義：將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。第三十五頁，共九十一頁。微囊化法制備固定化酶有兩種方法界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有機相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。界面聚合法：是用化學手段制備微囊的方法。利用油水界面上發生聚合反應形成聚合體而將酶包裹起來。癸二酰氯，氯仿酶，水，乙二胺第三十六頁，共九十一頁。第三節固定化酶的性質及其影響因素一、影響固定化酶性質的因素二、固定化后酶性質的變化三、評價固定化酶的指標第三十七頁，共九十一頁。一、影響固定化酶性質的因素1．酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結構和電荷狀態等發生了變化。2．載體的影響（1）分配效應（2）空間障礙效應（3）擴散限制效應3.固定化方法的影響第三十八頁，共九十一頁。二、固定化后酶性質的變化1．固定化對酶活性的影響：酶活性下降，反應速度下降原因：酶結構的變化空間位阻2．固定化對酶穩定性的影響（1）操作穩定性提高（2）貯存穩定性比游離酶大多數提高。（3）對熱穩定性，大多數升高，有些反而降低。（4）對分解酶的穩定性提高。（5）對變性劑的耐受力升高第三十九頁，共九十一頁。三、固定化后酶穩定性提高的原因固定化后酶分子與載體多點連接。酶活力的釋放是緩慢的。抑制自降解，提高了酶穩定性。第四十頁，共九十一頁。四、pH的影響（一）pH對酶活性的影響：（1）改變酶的空間構象（2）影響酶的催化基團的解離（3）影響酶的結合基團的解離（4）改變底物的解離狀態，酶與底物不能結合或結合后不能生成產物。第四十一頁，共九十一頁。（二）pH對固定化酶的影響1.載體帶負電荷，pH向堿性方向移動。2.載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。

微環境是指在固定化酶附近的局部環境，而把主體溶液稱為宏觀環境。第四十二頁，共九十一頁。催化反應的產物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高。催化反應的產物為堿性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值低。（三）產物性質對體系pH的影響第四十三頁，共九十一頁。（四）最適溫度變化作用于低分子底物的酶，特異性沒有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特異性往往會變化。一般與游離酶差不多，但有些會有較明顯的變化。（五）底物特異性變化第四十四頁，共九十一頁。（六）米氏常數Km的變化，Km值隨載體性質變化（1）載體與底物帶相同電荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的親和力。（2）載體與底物電荷相反，靜電作用，Km’<Km。第四十五頁，共九十一頁。五、評價固定化酶的指標：1.酶活定義（IU)：在特定條件下，每一分鐘催化一個微摩爾底物轉化為產物的酶量定義為1個酶活單位。2.酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位（一）游離酶第四十六頁，共九十一頁。1.固定化酶的比活：

每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。或：單位面積（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：

連續測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（t1/2），是衡量穩定性的指標。（二）固定化酶第四十七頁，共九十一頁。5.相對酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力

3.4.酶活力回收率也稱偶聯效率，活力保留百分數。第四十八頁，共九十一頁。六、固定化酶的活力測定方法介紹1.振蕩測定法：2.酶柱測定法：3.連續測定法：利用連續分光光度法等測定方法可以對固定化酶反應液進行連續測定，從而測定固定化酶的酶活力。第四十九頁，共九十一頁。第四節微生物、植物和動物細胞固定化細胞特性比較細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/um20-3001-1010-100倍增時間/h>120.3-6>15營養要求簡單簡單復雜光照要求大多數要光照不要求不要求對剪切力敏感大多數不敏感敏感主要產物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗體、酶第五十頁，共九十一頁。固定化細胞定義：固定在載體上并在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞稱為固定化細胞.該細胞能進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細胞或固定化增殖細胞。第五十一頁，共九十一頁。固定化細胞的特點類型：微生物細胞、植物細胞、動物細胞生理狀態：死細胞（完整細胞、細胞碎片、細胞器）活細胞（增殖細胞、靜止細胞、完整細胞）形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規則形狀。

使用周期：理論上講，固定化增殖細胞保持了細胞原有的全部活性，只要載體不解體，不污染就可以長期使用。第五十二頁，共九十一頁。細胞固定化方法吸附法包埋法第五十三頁，共九十一頁。吸附法定義：通過載體與細胞間的靜電引力，即細胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細胞固定在載體上的。pH3－5------------++++++++第五十四頁，共九十一頁。影響吸附法的主要因素

Z-電位：Z-電位能近似地代表表面電荷密度的大小細胞的性質和細胞壁的組成：細胞壁的電荷性質載體的性質：特別是玻璃、陶瓷等無機材料第五十五頁，共九十一頁。包埋固定法

包理法是在細胞自身并不與凝膠基體發生化學鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內的一種固定化方法。包埋法的最大優點是能較好的保持細胞內多酶系統的活力，可象游離細胞那樣進行產物的發酵生產。第五十六頁，共九十一頁。包埋法常用載體：瓊脂海藻酸鈣角叉菜膠明膠聚丙烯酰胺第五十七頁，共九十一頁。舉例：海藻酸鈣包埋法基本原理是：稱取一定量的海藻酸鈉配成水溶液，經殺菌冷卻后，與一定體積的細胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器或滴管將冷懸液滴入一定濃度的凝固浴中（常用CaCl2溶液），形成球狀固定化細胞。第五十八頁，共九十一頁。研究熱點——光交聯樹脂包埋法

例：相對分子量為1000-3000的光交聯聚氨酯預聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃，然后與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得。第五十九頁，共九十一頁。第五節固定化原生質體和輔酶一、原生質體的制備二、固定化三、輔酶固定化第六十頁，共九十一頁。一、原生質體的制備將對數生長期的細胞收集——懸浮在含有滲透壓穩定劑的高滲緩沖液中——加入水解酶——分離——得到原生質體第六十一頁，共九十一頁。二、原生質體固定化的方法將原生質替制備好后，把離心收集到的原生質體重新懸浮在含有滲透壓穩定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質體。第六十二頁，共九十一頁。三、輔酶固定化原因有機輔因子中具有某些特殊的化學基團，參與酶的催化反應有機輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生有機輔因子價格昂貴——工業上應用全酶的關鍵是有機輔因子的保留和再生第六十三頁，共九十一頁。輔酶固定化的方法固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯法等共價偶聯，或將其進行適當的化學修飾后固定在超濾器中。輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。

第六十四頁，共九十一頁。輔酶的固定化第六十五頁，共九十一頁。第六十六頁，共九十一頁。輔酶固定化的形式第六十七頁，共九十一頁。第六節酶反應器和固定化酶（細胞）的應用酶反應器介紹反應器選擇的依據反應器和酶穩定性固定化酶和細胞的應用（工農業、醫藥、分析化學、酶電極、親和色譜、環境保護、能源開發、基礎理論研究）第六十八頁，共九十一頁。一、酶反應器1．分批攪拌反應器。2．連續流攪拌桶反應器。3．連續攪拌桶-超濾反應器4．填充床反應器5．循環反應器6．流化床反應器定義：用于各種酶進行催化反應的容器及其附屬設備。類型：第六十九頁，共九十一頁。1．分批攪拌反應器反應器結構簡單，不需要特殊裝置，適與小規模試驗第七十頁，共九十一頁。2．連續流攪拌桶反應器第七十一頁，共九十一頁。3．連續攪拌桶-超濾反應器酶循環第七十二頁，共九十一頁。4．填充床反應器第七十三頁，共九十一頁。5．循環反應器第七十四頁，共九十一頁。6．流化床反應器與連續流攪拌桶式反應器類似，是讓適量的顆粒狀酶懸浮于反應床中，不用攪拌器，而是底物向上流過固定酶床，因此流速要適當控制。第七十五頁，共九十一頁。反應器選擇酶的形式：底物的物理性質：酶反應動力學酶的穩定性操作要求、應用和可塑性成本第七十六頁，共九十一頁。反應器和酶的穩定性反應器中酶催化活性損失的原因：酶本身失效酶從載體上脫落載體肢解擴散限制效應第七十七頁，共九十一頁。二、固定化酶（細胞）的應用1.

固定化酶（細胞）在工農業生產上的應用2．固定化酶在醫藥治療上的應用3．固定化酶在分析化學中應用4．固定化酶和親和色譜5．固定化酶與環境保護6．新能源開發中的應用7．固定化酶在基礎理論研究中應用第七十八頁，共九十一頁。1．固定化酶（細胞）在工農業生產上的應用葡萄糖異構酶——世界上生產規模最大的一種固定化酶。利用固定化乳糖酶可以連續生產低乳糖奶固定化酵母細胞等微生物可用于生產各種酒類熱點：固定化原生質體的應用第七十九頁，共九十一頁。2．固定化酶在醫藥治療上的應用例1固定化青霉素酰化酶，只要改變pH值等條件，就可以生成不同的產物。第八十頁，共九十一頁。青霉素酰化酶催化合成頭孢類抗生素

7-ACAasnucleus第八十一頁，共九十一頁。7-ACCAor7-ADCA