第三部分鑒定技術(shù)生物活性分子的分離與表征第10章、電泳技術(shù)第11章、定量分析技術(shù)第12章、組分分析技術(shù)第13章、生物活性測(cè)定技術(shù)第13章、生物活性測(cè)定技術(shù)13.1、概述13.2、酶最適反應(yīng)條件的測(cè)定13.3、酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定13.4、酶促反應(yīng)的影響因素13.5、實(shí)例

在酶的分離純化、性質(zhì)研究以及酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用時(shí)，都要遇到對(duì)酶的活性、純度及含量進(jìn)行經(jīng)常的、大量的測(cè)定工作，這是必不可少的指標(biāo)。

要研究某種酶，首先必須建立起該酶活性的測(cè)定方法。酶活性是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力，檢查酶的含量及存在，通常是用該酶在一定條件下催化某一特定反應(yīng)的速度，即酶的活性來(lái)表示。

13.1、概述一、酶活性單位

酶活性指的是酶制劑催化能力的大小，它既與酶分子的濃度（量）有關(guān)，又與酶分子催化能力的大小（質(zhì)）有關(guān)。人們規(guī)定一定的催化能力為一個(gè)酶活性單位。液體酶制劑的酶濃度用單位體積酶制劑所含的酶活性單位來(lái)表示，即u/ml。對(duì)于固體狀態(tài)的酶制劑，其酶含量可用單位質(zhì)量酶制劑所含的酶活性單位來(lái)表示，即u/mg。國(guó)際酶活性單位1961年，國(guó)際酶學(xué)會(huì)議為酶活性單位規(guī)定了一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，即在特定的條件下（一般為酶催化反應(yīng)的最適條件），1分鐘轉(zhuǎn)化1μmol底物，或轉(zhuǎn)化1μN(yùn)底物有關(guān)基團(tuán)所需的酶量為1個(gè)國(guó)際單位（IU）。比活性

酶的純度往往用比活性來(lái)表示，比活性是用同一酶制劑的酶活性除以蛋白質(zhì)的質(zhì)量，即單位質(zhì)量蛋白質(zhì)所具有的酶活性，常用的單位為u/mgprotein。酶制劑的比活性越高說(shuō)明酶的純度越高。二、酶活性測(cè)定的主要方法

溫度、pH、離子強(qiáng)度（I=(1/2)ΣCZ2）等因素對(duì)酶活性有很大的影響，測(cè)定酶活性時(shí)一般采用最適環(huán)境條件。若酶催化反應(yīng)時(shí)需要輔助因子，應(yīng)加入最適量的輔助因子。底物濃度應(yīng)采用零級(jí)反應(yīng)時(shí)的底物濃度，這時(shí)反應(yīng)速度只與酶濃度有關(guān)，而與底物濃度無(wú)關(guān)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物濃度越來(lái)越高，而底物濃度越來(lái)越低，導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，所以測(cè)酶活性時(shí)應(yīng)測(cè)反應(yīng)的初速度，即反應(yīng)開(kāi)始后較短一段時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速度（反應(yīng)了的底物不超過(guò)5%）。

1

分光光度法（spectrophotometry）

硝酸還原酶將NO3－

還原成NO2－，NO2－

與加入的顯色劑對(duì)－氨基苯磺酸和α－萘胺反應(yīng)生成玫瑰紅色的偶氮化合物，在520nm處比色可測(cè)定產(chǎn)物的生成量。一些脫氫酶以NAD+或NADP+為輔酶，NAD+或NADP+在340nm處光吸收很少，而其還原形式NADH和NADPH在340nm處光吸收較大，因此可以測(cè)定340nm處的光吸收變化來(lái)檢測(cè)NADH和NADPH的生成或減少，從而得知脫氫酶的活性。乳酸脫氫酶催化的反應(yīng)乳酸脫氫酶2旋光測(cè)定法（polarimetry）

若底物和產(chǎn)物的旋光性不同，可通過(guò)測(cè)定反應(yīng)混合物的旋光性（方向和大小）變化來(lái)測(cè)定酶活性。3熒光法（fluorescence）

氧化態(tài)的黃素（flavin）化合物發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，還原態(tài)失去熒光。NAD+

和NADP+無(wú)熒光，而NADH和NADPH有460nm藍(lán)色熒光。熒光法靈敏度高。4同位素測(cè)定法（isotopedetermination）

用放射性同位素標(biāo)記底物，酶反應(yīng)后分離產(chǎn)物，測(cè)產(chǎn)物的放射性強(qiáng)度。此法靈敏度高，但分離產(chǎn)物較麻煩。若底物或產(chǎn)物中有一種是氣體或沉淀，就易于分離。5電化學(xué)方法（electrochemistry）

①pH測(cè)定：對(duì)于某些酶促反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生H＋或減少H＋的反應(yīng)來(lái)說(shuō)，用1/1000pH單位精度的pH計(jì)測(cè)定反應(yīng)液的pH變化，或?yàn)楸３謕H不變而加入酸或堿，記錄一段時(shí)間內(nèi)加入的酸堿量。②電位測(cè)定：在一些酶促氧化還原反應(yīng)中，底物和產(chǎn)物具有不同的氧化還原電位，可用由一恒定微電流極化的兩個(gè)鉑電極之間的電位差來(lái)測(cè)定電位變化。③電流測(cè)定：以恒定電壓的兩個(gè)鉑電極測(cè)電流變化。6化學(xué)分析法（chemicalanalysis）

酶促反應(yīng)一段時(shí)間后，取出一部分反應(yīng)液，用化學(xué)方法分析底物或產(chǎn)物的量。如ACC合成酶的產(chǎn)物ACC的測(cè)定：加HgCl2終止反應(yīng)，加NaOCl-NaOH混合液使ACC轉(zhuǎn)化成乙烯，再用氣相色譜測(cè)乙烯。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）13.2、酶最適反應(yīng)條件的測(cè)定

最適反應(yīng)溫度溫度穩(wěn)定性最適反應(yīng)pHpH穩(wěn)定性一、溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響溫度-酶反應(yīng)速率曲線與最適溫度（optimumtemperature）Fig.Theeffectoftemperatureonenzymeactivity.二、pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響pH-酶反應(yīng)速率曲線與最適pH（optimumpH）Fig.TheeffectofpHonenzymeactivity.Tab.OptimumpHofsomeenzymes胃蛋白酶過(guò)氧化氫酶胰蛋白酶延胡索酸酶核酶精氨酸酶13.3、酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定1．米氏方程Km為米氏常數(shù)（一）酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)式米氏方程：K4（二）米氏常數(shù)Km1．Km的含義:

當(dāng)Km=[S]時(shí)，V=

Vmax/2，Km值等于反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率Vmax一半時(shí)的底物濃度。2．Km的意義Km是酶的一個(gè)特征性常數(shù)反映酶對(duì)底物親和力的大小鑒別酶的種類

判斷可逆反應(yīng)的速率

（三）Vmax定義：Vmax表示在一定酶量時(shí)的最大反應(yīng)速率，即酶完全被底物所飽和時(shí)的反應(yīng)速率，與酶活性濃度呈正比。應(yīng)用：計(jì)算酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（TN，催化常數(shù)Kcat）單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子將底物分子轉(zhuǎn)換成產(chǎn)物的最大值。計(jì)算公式為：

(單位是s-1)計(jì)算時(shí)要保證酶的濃度單位與底物的濃度單位一致酶反應(yīng)速度與[S]的關(guān)系1.[S]＜＜

Km時(shí)：

υ=Vmax[S]/

Km

一級(jí)反應(yīng)2.若[S]＞＞Km時(shí)：

υ=Vmax

零級(jí)反應(yīng)3.若[S]=Km時(shí)：

υ=1/2Vmax

Km值的求法：

根據(jù)米氏方程雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk)-1/Km1/Vmax斜率=Km/VmaxFig.TheLineweaver-Burkdouble-reciprocalplot13.4、酶促反應(yīng)的影響因素激活劑抑制劑1.激活劑激活劑（activator）無(wú)機(jī)離子中等大小的有機(jī)分子蛋白質(zhì)金屬離子:無(wú)機(jī)陰離子:氫離子K+、Na+、Ca2+、Mg2+

、Zn2+

等。Cl-等。某些還原劑：GSH、Cys、Vc金屬螯合劑：EDTA提高酶活性。2．抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響

抑制作用

inhibition抑制劑

inhibitor

抑制作用：酶分子中的必需基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)受到某種化學(xué)物質(zhì)的影響而改變，導(dǎo)致酶活性降低，甚至喪失，但并未引起酶蛋白的變性作用。(1)不可逆抑制作用（irreversibleinhibition)抑制劑以共價(jià)鍵和酶分子上必需基團(tuán)結(jié)合（牢固結(jié)合），使酶活性降低或喪失，這種抑制劑不能用透析、超濾等物理方法解除抑制作用。不可逆抑制專一性的不可逆抑制

非專一性的不可逆抑制(2)可逆抑制(ReversibleInhibition)

通常以非共價(jià)鍵與酶和（或）酶-底物復(fù)合物結(jié)合，使酶活性降低或消失。采用透析或超濾等物理方法可將抑制劑除去，使酶恢復(fù)活性。類型：競(jìng)爭(zhēng)性抑制（competitiveinhibition）非競(jìng)爭(zhēng)抑制（noncompetitiveinhibition）反競(jìng)爭(zhēng)抑制（uncompetitiveinhibition）

1)競(jìng)爭(zhēng)性抑制ki2ki1Vmaxv[S]（不變）KmKm(變大)WithcompetitiveinhibitorNoinhibitor?

競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線VmaxKmv1=)[I][ki](1++Vmax1[S]11/[S][I]1/v[I][ki]-Km(1+)-1-1/KmNoinhibitorWithcompetitiveinhibitorFig.Lineweaver-Burkplotofcompetitiveinhibitio13.2)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制Fig.Noncompetitiveinhibition[S]vVmaxVmax（變小）Km(不變)NoinhibitorWithnoncompetitiveinhibitorFig.Noncompetitiveinhibitio13.NoinhibitorWithnoncompetitiveinhibitor[I]1/[S]1/v-1/KmVmax1[I][Ki](1+)[S]1VmaxKmv1=)[I][ki](1++Vmax1)[I][ki](1+3)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制1/v1/[S]-1/Km(1+[I]/ki)[I]正常表.三種抑制作用總結(jié)類型米氏方程VmaxKm無(wú)抑制劑v=Vmax[S]/(Km+[S])VmaxKm競(jìng)爭(zhēng)性抑制v=Vmax[S]Ki/(Km

Ki+Km[I]+Ki[S])不變?cè)黾臃歉?jìng)爭(zhēng)性抑制v=Vmax[S]Ki/(Km+[S])(Ki+[I])減小不變反競(jìng)爭(zhēng)性抑制v=Vmax[S]Ki/(Km

Ki+[S]Ki+[S][I])減小減小13.5、實(shí)例

菲律賓蛤仔堿性磷酸酶的酶學(xué)性質(zhì)研究最適溫度溫度穩(wěn)定性最適pHpH穩(wěn)定性酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定金屬離子對(duì)酶活性的影響有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響酶活測(cè)定：取緩沖液2.4mL于試管中，加入0.5mL0.01mol/LPNPP，45℃水浴10min，加入0.1mL酶液，1min后加入1mL1mol/LNaOH終止反應(yīng)。對(duì)照組先加入1mL1mol/LNaOH，再加入0.1mL酶液。最后用分光光度計(jì)測(cè)定405nm處的吸光度。一個(gè)酶活力單位定義：在此反應(yīng)條件下，每毫升溶液每分鐘催化底物水解，產(chǎn)生1μmol產(chǎn)物所需的酶量。1、最適反應(yīng)溫度

在pH9.0條件下，分別測(cè)定ALP在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃反應(yīng)體系中的酶活力。以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)，繪制酶活變化曲線。2、溫度穩(wěn)定性研究將純酶液與適量0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH9.0，含0.1mol/LNaCl）混合，分別在25℃、35℃、45℃、55℃放置4h，每小時(shí)測(cè)定一次酶活力。以靜置時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)，繪制酶活變化曲線。3、最適反應(yīng)pH

在最適反應(yīng)溫度條件下，分別測(cè)定ALP在pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0反應(yīng)體系中的酶活力。其中，pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的緩沖液為0.05mol/LTris-HCl緩沖液；pH9.5、10.0、10.5的緩沖液為0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液；pH11.0的緩沖液為磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液。以反應(yīng)pH為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)，繪制酶活變化曲線。4、pH穩(wěn)定性研究

將純酶液與適量pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0的緩沖液混合，4℃冰箱內(nèi)放置4h后，在最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH條件下，測(cè)定剩余酶活力。其中，pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的緩沖液.05mol/LTris-HCl緩沖液；pH9.5、10.0、10.5的緩沖液為0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液；pH11.0的緩沖液為磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液。以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)，繪制酶活變化曲線。5、酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

在最適溫度和最適pH條件下，測(cè)定不同底物濃度下的反應(yīng)初速度（V），采用LineweaverBurk法作圖，求出米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。6、金屬離子對(duì)酶活性的影響

在酶活測(cè)定反應(yīng)體系中加入不同濃度的金屬離子，其中加入氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣至終濃度分別為1mmol/L、5mmol/L、25mmol/L、50mmol/L；加入氯化鋇、三氯化鐵、