dldhierarch2013.06.22Lrp5/6在高血脂所致損傷時所扮演的角色的探究計劃01、用高脂飼料喂養ApoE基因敲除小鼠建立高脂損傷模型ApoE基因敲除小鼠模擬高血脂損傷模型的機理/ApoE基因的作用用何種指標或手段確認高血脂損傷模型的建立02、Lrp5/6在高脂損傷時表達水平的探索體外用Ox-LDL刺激huv-ec細胞，看膜上的Lrp5/Lrp6水平的表達取小鼠的血管內皮細胞體外培養，重復OX-LDL刺激實驗03、Lrp5/6在高脂損傷時所起作用的探索取已建立好ApoE基因敲除小鼠高脂損傷模型的小鼠各臟器觀察Lrp5/6及βCatenin的表達水平的變化如Lrp5/6在其中扮演角色，則研究其內在機制（何種通路等）體內探索Lrp5/6在高血脂損傷時所扮演的角色ApoE（apolipoproteinE/載脂蛋白E）載脂蛋白是血漿脂蛋白（脂-蛋白復合物）中的蛋白部分。載脂蛋白是構成血漿脂蛋白的蛋白質組分，主要在肝臟（部分在小腸）合成，主要分類由A、B、C、D、E五類。基本功能是運載脂類物質及穩定脂蛋白的結構，某些載脂蛋白還有激活脂蛋白代謝酶、識別受體等功能。ApoE結構及功能簡介血漿脂蛋白是哺乳動物血漿中的脂—蛋白復合物，能夠和脂類（甘油三酯、磷脂、膽固醇等）結合從而實現在血漿中運輸脂類（跨器官運輸）（1）脂—蛋白的結合機制脂蛋白中脂質與蛋白質之間沒有共價鍵結合，多數是通過脂質的非極性部分與蛋白質組分之間以疏水性相互作用而結合在一起。一般認為血漿脂蛋白都具有類似的結構，呈球狀，在顆粒表面是極性分子，如蛋白質、磷脂，故具有親水性；非極性分子如甘油三酯、膽固醇酯則藏于其內部。磷脂的極性部分可與蛋白質結合，非極性部分可與其它脂類結合，作為連接蛋白質和脂類的橋梁，使非水溶性的脂類固系在脂蛋白中。（2）脂蛋白的分類及功能dldhierarch脂蛋白的分類及功能：01、乳糜微粒（chylomicron，CM）——顆粒最大，密度最低約為500nm大小，脂類含量高達98%，蛋白質含量少于2%，因此密度極低。主要功能為運輸外源性甘油三酯。02、極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein，VLDL）VLDL中脂類占85%-90%，其中甘油三酯（TG）占55%，其密度也很低；VLDL的功能為運輸內源性甘油三酯（肝臟中由脂肪酸和葡萄糖合成）。03、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein，LDL）04、高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，HDL）dldhierarch03、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein，LDL）主要功能是把膽固醇（是攜帶膽固醇最多的脂蛋白）從肝臟運輸到全身各處細胞，經代謝進行清除。（1）受體介導途徑清除（主要是Apo蛋白配體+LDL受體）——約2/3體內2/3的LDL是通過受體介導途徑吸收入肝和肝外組織，經代謝而清除的。在血管運輸過程中，當LDL，尤其是OX-LDL（氧化修飾的低密度脂蛋白）過量時，它攜帶的膽固醇便積存在動脈壁上，長期積累容易引起動脈硬化。因此LDL被稱為“壞的膽固醇”。（2）非受體通路（巨噬細胞吞噬LDL）——約1/3巨噬細胞與LDL結合，吸收LDL中的膽固醇，這樣膽固醇就留在細胞內，變成“泡沫”細胞。因此，LDL能夠進人的動脈壁細胞，并帶入膽固醇。所以LDL水平過高能夠導致動脈粥樣硬化的發生。dldhierarch04、高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，HDL）

顆粒最小密度最高的血漿脂蛋白，其直徑為7.5～10nm，密度為1.21g/cm3，含有6%膽固醇、13%膽固醇酯與50%蛋白質，其載脂蛋白大多為ApoA（載脂蛋白A）。生理功能和意義主要功能為將內源性膽固醇從組織向肝臟進行逆向轉運，在肝臟內轉化為膽汁酸或直接轉化為膽汁從腸道中排出。降低了膽固醇在血管中沉積的風險。因此HDL能夠抵抗血管粥樣硬化的形成，是“好的膽固醇”被譽為“血管清道夫”。同時HDL具有逆轉內皮功能不良、刺激PIG2（前列環素，具有擴血管和抗血栓形成作用）生成，抑制血管內皮細胞凋亡、減少血小板聚集、抑制LDL氧化（即減少OX-LDL生成）等許多功能。1985年諾貝爾生理學獎成果——膽固醇代謝調節機制美國德克薩斯大學的Michael·S·Brown和Joseph·L·GoldsteindldhierarchApoE蛋白結構及功能簡介ApoE主要由肝臟合成，近年來發現腦，腎，骨骼，腎上腺及巨噬細胞也能合成。ApoE生理功能：①是LDL受體的配體，也是肝細胞CM殘粒受體的配體，它與脂蛋白代謝有密切相關性；②ApoE具有多態性，多態性是決定個體血脂水平與動脈粥樣硬化發生發展密切相關；③參與激活水解脂肪的酶類，參與免疫調節及神經組織的再生。ApoE基因敲除小鼠構建AS（動脈粥樣硬化）的模型的機制ApoE基因敲除小鼠構建AS（動脈粥樣硬化）的模型的機制ApoE蛋白能夠是通過不同機制對動脈粥樣硬化起到一定的抑制作用。模擬機理ApoE是構成CM

(乳糜微粒)、VLDL

(極低密度脂蛋白)及HDL

(高密度脂蛋白)的重要成分，它作為一種清除配體，參與受體介導的載脂蛋白清理過程，主要介導血漿脂蛋白特別是乳糜微粒和低密度脂蛋白的代謝與清除，在脂蛋白代謝巾發揮重要作用。因此當ApoE基因敲除后，可導致TC（總膽固醇）、LDL-C（低密度脂蛋白膽固醇）升高，誘發動脈內膜損傷及脂質沉積，最終發展成動脈粥樣硬化。

SpontaneoushypercholesterolemiaandarteriallesionsinmicelackingapolipoproteinE.Science,1992

Oct16;258(5081):468-71.模型優點以往的As動物模型大多以高脂肪、高膽固醇膳食負荷喂養，其As病理變化機制與人類As的形成有較大的差異。dldhierarch高血脂損傷模型建立確認的指標脂質代謝異常與動脈粥樣硬化的發生和發展具有密切的關系。載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠可出現高脂血癥并形成動脈粥樣硬化，因而成為理想的動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)模型。SeverehypercholesterolernicaandatherosclerosisinapolipoproteinE-deficientmicecreatedbyhomoIogousrecombinationinEScells.Cell,

Volume71,Issue2,343-353,16October1992血脂生化分析指標血管超聲檢查病理切片指標血管內皮細胞凋亡指標CT血管造影檢查dldhierarch總膽固醇（TC）甘油三酯（TG）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）血脂生化分析指標dldhierarchApoE-/-小鼠As病變通常是從主動脈根部、升主動脈開始形成，并在冠狀動脈、主動脈弓及其分叉處、頸總動脈及其分叉處、胸主動脈、腹主動脈、雙腎動脈等處均可形成斑塊，與人類As好發處相近。由于ApoE-/-小鼠As病變是從主動脈根部開始發生，為了觀測早期As的病變特征，可以采用UBM（超聲生物顯微鏡，ultrasoundbiomicroscopy）成像觀察ApoE-/-小鼠主動脈根部的形態學和IMT（主動脈后壁內-中膜厚度）變化。Non-invasivereal-timeimagingofatherosclerosisinmiceusingultrasoundbiomicroscopy.Atherosclerosis.2007.190(2)

Ultrasoundbiomicroscopynoninvasiveassessmentofatherosclerosisinapolipoprotein-Eknockoutmice.UltrasoundinMed&Bio,2011dldhierarch血管超聲檢查dldhierarch用Ox-LDL刺激huv-ec細胞和體外培養的小鼠血管內皮細胞以探究細胞膜上的Lrp5/6的表達水平huv-ec

cell（人臍靜脈內皮細胞，HumanUmbilicalVeinEndothelialCells）HUV-EC-C(ATCC?

CRL-1730?)OX-LDL（Oxidizedlow-densitylipoprotein,氧化型低密度脂蛋白）OX-LDL喜好在血管內皮受損部位即血管斑塊部位聚集，它能夠誘導血管壁內巨噬細胞泡沫化，并在其局部引發一連串的多種細胞參與的炎癥反應，從而導致不同程度的動脈粥樣硬化。dldhierarchApoE基因敲除小鼠模型的建立及對照組的設置看時間梯度結合高血脂損傷的諸項指標觀察Lrp5/6表達水平的變化及差異dldhierarchLrp5/6在高脂損傷時所扮演角色的的探索用Lrp5/