Chapter9

MolecularMarker分子標(biāo)記概念的界定廣義的分子標(biāo)記(molecularmarker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上基因位點編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納。本章中也將分子標(biāo)記概念限定在DNA標(biāo)記范疇。

分子標(biāo)記--能夠用來作為指紋鑒定或區(qū)分個體特點的DNA片段。這種標(biāo)記在遺傳學(xué)研究和生物技術(shù)應(yīng)用方面越來越成為有用的工具。基本前提:個體間存在的自然遺傳變異，進(jìn)而造成許多遺傳序列的多態(tài)性，即這些序列在不同的個體表現(xiàn)不同。理想的分子標(biāo)記的界定

理想的分子標(biāo)記必須達(dá)到以下幾個要求：(1)具有高的多態(tài)性；(2)共顯性遺傳，即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型；(3)能明確辨別等位基因；(4)遍布整個基因組；(5)除特殊位點的標(biāo)記外，要求分子標(biāo)記均勻分布于整個基因組；(6)選擇中性（即無基因多效性）；(7)檢測手段簡單、快速（如實驗程序易自動化）；(8)開發(fā)成本和使用成本盡量低廉；(9)在實驗室內(nèi)和實驗室間重復(fù)性好（便于數(shù)據(jù)交換）。

分子標(biāo)記技術(shù)的分類第一類：以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)第二類：以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)第三類：新型的分子標(biāo)記技術(shù)第一節(jié)以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)(一)DNA指紋技術(shù)（DNAFingerprinting）(二)原位雜交（insituhybridization）Southern印跡在20世紀(jì)60年代，Southern首先發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星DNA由很多短的重復(fù)片段串聯(lián)在一起。與此同時，HamSimth

發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型核酸內(nèi)切酶。southern純化EcoRⅡ。Southern用EcoRⅡ酶切衛(wèi)星DNA，電泳后凝膠中出現(xiàn)了梯狀條帶（ladder）。他將5SrRNA基因組DNA通過一種或幾種限制酶消化后，通過瓊脂糖電泳按照大小分離，然后將DNA經(jīng)過原位變性后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，再與有放射性標(biāo)記的5SrRNA雜交，通過放射性自顯影確定了5SRNA基因在基因組上的位置。1987年用southernblotting方法發(fā)現(xiàn)，在美國黑人中，導(dǎo)致鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥的β－球蛋白突變，在其基因在酶切位點附近有多態(tài)性，該發(fā)現(xiàn)使得可以使用southernblotting檢測DNA來直接地跟蹤疾病相關(guān)基因?！拗破瑪嚅L度多態(tài)性（RFLP）隨著人類基因組計劃的開展，southern開發(fā)出了寡核苷酸微陣列（oligonuleotidearrays）RFLP，Oligonuleotidearrays1984年9月11日，英國科學(xué)家亞歷克·杰夫里斯和同事在研究基因變異時，偶然發(fā)現(xiàn)基因中存在一些足以區(qū)分生物個體的微小結(jié)構(gòu)，并于當(dāng)天繪制出了世界上第一幅“DNA指紋”，他們此后將這些結(jié)構(gòu)稱為“隨體”。DNA指紋技術(shù)

(一)

DNA指紋技術(shù)（DNAFingerprinting）--用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA,并用特異性核酸探針雜交，取得不同大小的DNA片段的區(qū)帶圖譜,該圖譜具有高度的個體特異性，類似于人的指紋。類型限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性（Variblenumberoftandemrepeats，VNTR)限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記

(Restrictonfragmentlengthpolymorphism,RFLP)RFLP—特定生物類型的基因組DNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全水解后，產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段，或稱限制性等位片段。凡是可以引起酶解位點變異的突變，如點突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點）和一般DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化，從而產(chǎn)生RFLP。1974,Grodzicker,etal.found.基本步驟DNA提取DNA限制性內(nèi)切酶消化凝膠電泳分離限制性片段將這些片段按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（Southernblot）放射性自顯影或酶學(xué)檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態(tài)性RFLP標(biāo)記的主要特點遍布于整個基因組，數(shù)量幾乎是無限的;無表型效應(yīng)，不受發(fā)育階段及器官特異性限制；結(jié)果穩(wěn)定、可靠；DNA需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實踐中。1980年Wyman等發(fā)現(xiàn)了在未知的物理圖譜位置存在高度可變的多等位基因位點。Jeffreys在分析球蛋白基因家族的myoglobin時發(fā)現(xiàn)在其基因內(nèi)部有一個小衛(wèi)星DNA序列，并且它們的重復(fù)特征和其他基因中發(fā)現(xiàn)的序列具有相似性。然后Jeffreys用這些發(fā)現(xiàn)的小衛(wèi)星序列來篩選人類基因組文庫，分離得到了其它的一些可變基因座。測序后發(fā)現(xiàn)：這些小衛(wèi)星序列共有一個10-15bp的基序（motif）。Jeffreys又利用southernblotting的方法將這些小衛(wèi)星序列和來自不同物種的基因組DNA片斷進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)甚至在一個家庭中這些DNA的特征也是高度可變的。VNTR’s

和DNA指紋數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性

（

Variblenumberoftandemrepeats，VNTR）VNTR—一類叫小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA），其核心序列長11～16bp，多存在于異染色質(zhì)區(qū)域（如端粒、隨體、基因非編碼區(qū)）；另一類叫微小衛(wèi)星DNA或微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA），其核心序列長僅2～5bp，故亦稱為STR（短串聯(lián)重復(fù)，shorttandemrepeat），廣泛分布于基因組中。凡是核心序列相同的VNTR屬于一種VNTR，盡管它們的長度、重復(fù)次數(shù)和分布位點可能不一樣。英國的遺傳學(xué)家AlecJeffreys在進(jìn)行肌紅蛋白的DNA序列研究時，意外發(fā)現(xiàn)非功能DNA（不產(chǎn)生蛋白的DNA）上重復(fù)著一種小片段DNA，這一含15個左右堿基的DNA片段，在不同個體間重復(fù)的頻率及位置有明顯的不同

VNTR的主要特點在人群中呈現(xiàn)出高度的多態(tài)性，即不同的人，同一種VNTR在染色體上的分布、數(shù)目和長度不盡相同。對于每一個個體來說，其VNTR的組成與分布卻相對穩(wěn)定（無論是在體細(xì)胞還是在生殖細(xì)胞中）。呈孟德爾共顯性遺傳。DNA指紋技術(shù)的應(yīng)用親子鑒定（VNTR）

親子鑒定風(fēng)行意大利（幾十萬）現(xiàn)代家庭“情流感”

犯罪分析血液、唾液、頭發(fā)、精液和其他出現(xiàn)在犯罪現(xiàn)場的樣品成為嫌疑犯被監(jiān)禁或釋放強有力的證據(jù)誤差率在百萬分之一以下，結(jié)果非常精確。

DNA身份證

DNA指紋技術(shù)讓你能擁有一張獨一無二的真正意義上的個人識別身份證。個人DNA基因身份證

southernblotting和DNA指紋技術(shù)的發(fā)明者（Edwin

Southern和AlecJJeffreys）在2005年因其發(fā)現(xiàn)的重要意義獲得了有醫(yī)學(xué)諾貝爾獎之稱的lasker獎。

（二）染色體原位雜交（insituhybrisization）染色體原位雜交技術(shù)：DNA探針與染色體上的DNA雜交，并在染色體上直接進(jìn)行檢測的分子標(biāo)記技術(shù)。熒光素標(biāo)記的原位雜交技術(shù)（fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）：利用與熒光素偶聯(lián)的單克隆抗體與抗原標(biāo)記的探針分子特異性的結(jié)合來檢測DNA序列在染色體上的位置。基本步驟：制備探針—染色體制片—染色體處理與變性—染色體與探針雜交—顯微檢測。特點：簡便，結(jié)果直觀；靈敏度和分辨率依賴于制片技術(shù)和觀察設(shè)備。用作植物染色體原位雜交的探針因研究目的不同有許多種，主要的有：用于物種起源和親緣關(guān)系研究的物種?；疍NA序列或外源物種總基因組DNA；用來構(gòu)建染色體物理圖譜的低拷貝或單拷貝序列；用于轉(zhuǎn)基因植物鑒定的含目的基因的BAC和YAC克隆。熒光原位雜交果蠅唾液染色體第二節(jié)以PCR反應(yīng)為核心的分子標(biāo)記單引物PCR標(biāo)記3’端具有選擇性的雙引物PCR標(biāo)記基于特異雙引物PCR的標(biāo)記類型隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RandomamplificationpolymorphismDNA,RAPD標(biāo)記）簡單序列重復(fù)標(biāo)記（Simplesequencerepeat,

SSR標(biāo)記）—錨定PCR(SSR—anchoredPCR)標(biāo)記序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（Sequencecharacteredamplifiedregion,SCAR標(biāo)記）AP-PCR(Arbitary

PrimedPCR)(引物10～50個堿基)DAF(DNA

Amplification

Fingerprinting)（引物短至5bp）SPARs(SinglePrimerAmplication

Reactions)標(biāo)記單引物PCR標(biāo)記3’端具有選擇性的雙引物PCR標(biāo)記擴(kuò)展片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP標(biāo)記）基于特異雙引物PCR的標(biāo)記真核生物基因組中的小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性，依據(jù)這些DNA序列設(shè)計雙引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增會產(chǎn)生新的遺傳標(biāo)記。例如:AMP-FLPs(Amplified-Fragment

LengthPolymorphismsRAPD—用隨機(jī)引物進(jìn)行基因組DNA的PCR擴(kuò)增,電泳分離擴(kuò)增片段,得到隨機(jī)擴(kuò)增的多肽性DNA片段圖譜。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。增加或缺少的PCR產(chǎn)物則為RAPD標(biāo)記。隨機(jī)擴(kuò)增多肽性DNA標(biāo)記

(RandomamplificationpolymorphismDNA,RFLP)1990,Williams,etal.found.無需DNA探針，無需知道序列的全部信息；技術(shù)簡便；DNA樣品需要量少，成本低；實驗重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性低；存在共遷移問題。RAPD標(biāo)記的主要特點簡單序列重復(fù)標(biāo)記

（Simplesequencerepeat,SSR）

SSR—根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的保守單拷貝序列設(shè)計一對引物，通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來，利用電泳分析技術(shù)可獲得其長度多肽性。1991,Moore,etal.found.微衛(wèi)星(microsatellite)或簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeats，縮寫SSR)，STMS(Sequence-taggedmicrosatellites)，SSRP(SimpleSequenceRepeatPolymorphisms)：

重復(fù)單位含有1-5個堿基（也有2-8個堿基）組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復(fù)。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。1989,Litt&Luty:Microsatellite主要特點廣泛分布于整個基因組，數(shù)量豐富；具有較多的等位性變異；共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；實驗重復(fù)性好，結(jié)果可靠；由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，可以在其它鐘的DNA數(shù)據(jù)庫中查詢，否則就必須先建立含有微衛(wèi)星的基因組文庫，再從中篩選可用的克隆，進(jìn)行測序，然后設(shè)計合適的引物。常用的分子標(biāo)記特性比較CharactersRFLPRAPDAFLPSSR分布普遍普遍普遍普遍可靠性高中等高高重復(fù)性高中等高高遺傳性共顯性顯性顯性或共顯性共顯性多態(tài)性中等高非常高高DNA需求2-30ng1-100ng100ng50-100ng放射性一般有無有或無無技術(shù)難度中等簡單中等簡單樣品生產(chǎn)率中低高非常高高時間因素長快中等快探針類型低拷貝DNA或cDNA克隆隨機(jī)序列特異DNA序列特異DNA重復(fù)序列探測部分低拷貝編碼區(qū)域整個基因組整個基因組整個基因組檢測位點1-31-1020-1001-5第三節(jié)新型的分子標(biāo)記單核苷酸多肽性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressedsequencestags,EST)單核苷酸多肽性

(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)同一位點的不同等位基因之間常常只有一個或幾個核苷酸的差異，因此在分子水平上對單個核苷酸的差異進(jìn)行檢測是很有意義的。目前SNP作為一種新的分子標(biāo)記，已有2000多個標(biāo)記定位于人類染色體上，在植物上也在進(jìn)行開發(fā)研究。檢測SNP的最佳方法是新近發(fā)展起來的DNA芯片技術(shù)。SNP發(fā)展背景第一張人類基因組序列正式圖于2003年4月完成。但序列圖只基于少數(shù)個體，它反映了基因組穩(wěn)定的一面，并未反映其變異或多態(tài)的一面，而正是這種多態(tài)性，即基因組序列的差異構(gòu)成了不同個體與群體對疾病的易感性、對藥物與環(huán)境因子不同反應(yīng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。人類基因組中存在廣泛的多態(tài)性，最簡單的多態(tài)形式是發(fā)生在基因組中的單個核苷酸的替代，即單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms,SNPs）。

SNP通常是一種二等位基因的（biallelic），即二態(tài)的遺傳變異，在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁。在轉(zhuǎn)錄序列上的SNP稱為cSNP。SNP的數(shù)量大、分布廣。按照1%的頻率估計，在人類基因組中每100～300個核苷酸就有一個SNP。因此，整個人類基因組（3.2X109bp）中至少有1,100萬以上的SNPs，在任何已知或未知基因內(nèi)和附近都可能找到數(shù)量不等的SNP。隨著分子遺傳學(xué)的進(jìn)展，疾病遺傳學(xué)研究從簡單的單基因疾病轉(zhuǎn)向于復(fù)雜的多基因疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松癥、糖尿病、心血管疾病、精神性紊亂、各種腫瘤等）與藥物基因組學(xué)的研究中。任一基因的多態(tài)性對疾病發(fā)生僅起微弱的作用。需要在人類基因組中找到一種數(shù)目多、分布廣泛且相對穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記。SNP作為遺傳標(biāo)記的優(yōu)勢

SNP自身的特性決定了它比其它兩類多態(tài)標(biāo)記更適合于對復(fù)雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識別等方面的研究。國外的SNP研究國際SNP研究組織TSC(TheSNPConsortium)

與國際人類基因組測序組織（theInternationalHumanGenomeSequencingConsortium）共同報道了人類因組中1.42百萬個SNPs

，使SNP的密度達(dá)到1/1.9kbSachidanandam等估計約60,000SNPs位于外顯子區(qū)域，這張高密度的SNP圖譜將有助于發(fā)現(xiàn)那些對疾病診斷與治療有益的重要基因。截止2001年5月，已有2.84百萬存放在NCBI的數(shù)據(jù)庫dbSNP

中

國內(nèi)的SNP研究應(yīng)用變性高效液相色譜（DHPLC）技術(shù)對冠心病患者的脂蛋白脂酶基因的SNP進(jìn)行了篩查；復(fù)旦大學(xué)遺傳所報道了漢族人群中腎上腺素能受體基因的SNP；上海人類基因組研究中心將DHPLC與直接測序法在SNP檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了比較研究，證明前者可有效地篩檢人類基因組中的SNP。表達(dá)序列標(biāo)簽

(Expressedsequencestags,EST)

EST技術(shù)直接起源于人類基因組計劃

原理：提取生