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Chapter9
MolecularMarker分子標(biāo)記概念的界定廣義的分子標(biāo)記(molecularmarker)是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶(指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式)及等位酶(指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式)。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記,而這個(gè)界定現(xiàn)在被廣泛采納。本章中也將分子標(biāo)記概念限定在DNA標(biāo)記范疇。
分子標(biāo)記--能夠用來(lái)作為指紋鑒定或區(qū)分個(gè)體特點(diǎn)的DNA片段。這種標(biāo)記在遺傳學(xué)研究和生物技術(shù)應(yīng)用方面越來(lái)越成為有用的工具。基本前提:個(gè)體間存在的自然遺傳變異,進(jìn)而造成許多遺傳序列的多態(tài)性,即這些序列在不同的個(gè)體表現(xiàn)不同。理想的分子標(biāo)記的界定
理想的分子標(biāo)記必須達(dá)到以下幾個(gè)要求:(1)具有高的多態(tài)性;(2)共顯性遺傳,即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型;(3)能明確辨別等位基因;(4)遍布整個(gè)基因組;(5)除特殊位點(diǎn)的標(biāo)記外,要求分子標(biāo)記均勻分布于整個(gè)基因組;(6)選擇中性(即無(wú)基因多效性);(7)檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速(如實(shí)驗(yàn)程序易自動(dòng)化);(8)開發(fā)成本和使用成本盡量低廉;(9)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)。
分子標(biāo)記技術(shù)的分類第一類:以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)第二類:以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)第三類:新型的分子標(biāo)記技術(shù)第一節(jié)以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)(一)DNA指紋技術(shù)(DNAFingerprinting)(二)原位雜交(insituhybridization)Southern印跡在20世紀(jì)60年代,Southern首先發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星DNA由很多短的重復(fù)片段串聯(lián)在一起。與此同時(shí),HamSimth
發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型核酸內(nèi)切酶。southern純化EcoRⅡ。Southern用EcoRⅡ酶切衛(wèi)星DNA,電泳后凝膠中出現(xiàn)了梯狀條帶(ladder)。他將5SrRNA基因組DNA通過(guò)一種或幾種限制酶消化后,通過(guò)瓊脂糖電泳按照大小分離,然后將DNA經(jīng)過(guò)原位變性后,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,再與有放射性標(biāo)記的5SrRNA雜交,通過(guò)放射性自顯影確定了5SRNA基因在基因組上的位置。1987年用southernblotting方法發(fā)現(xiàn),在美國(guó)黑人中,導(dǎo)致鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥的β-球蛋白突變,在其基因在酶切位點(diǎn)附近有多態(tài)性,該發(fā)現(xiàn)使得可以使用southernblotting檢測(cè)DNA來(lái)直接地跟蹤疾病相關(guān)基因。——限制片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)隨著人類基因組計(jì)劃的開展,southern開發(fā)出了寡核苷酸微陣列(oligonuleotidearrays)RFLP,Oligonuleotidearrays1984年9月11日,英國(guó)科學(xué)家亞歷克·杰夫里斯和同事在研究基因變異時(shí),偶然發(fā)現(xiàn)基因中存在一些足以區(qū)分生物個(gè)體的微小結(jié)構(gòu),并于當(dāng)天繪制出了世界上第一幅“DNA指紋”,他們此后將這些結(jié)構(gòu)稱為“隨體”。DNA指紋技術(shù)
(一)
DNA指紋技術(shù)(DNAFingerprinting)--用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA,并用特異性核酸探針雜交,取得不同大小的DNA片段的區(qū)帶圖譜,該圖譜具有高度的個(gè)體特異性,類似于人的指紋。類型限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(Variblenumberoftandemrepeats,VNTR)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記
(Restrictonfragmentlengthpolymorphism,RFLP)RFLP—特定生物類型的基因組DNA經(jīng)某一種限制性內(nèi)切酶完全水解后,產(chǎn)生分子量不同的同源等位片段,或稱限制性等位片段。凡是可以引起酶解位點(diǎn)變異的突變,如點(diǎn)突變(新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn))和一般DNA的重新組織(如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長(zhǎng)度發(fā)生變化)等均可導(dǎo)致限制性等位片段的變化,從而產(chǎn)生RFLP。1974,Grodzicker,etal.found.基本步驟DNA提取DNA限制性內(nèi)切酶消化凝膠電泳分離限制性片段將這些片段按原來(lái)的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA作探針與膜上的DNA雜交(Southernblot)放射性自顯影或酶學(xué)檢測(cè)顯示出不同材料對(duì)該探針的限制性酶切片段多態(tài)性RFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)遍布于整個(gè)基因組,數(shù)量幾乎是無(wú)限的;無(wú)表型效應(yīng),不受發(fā)育階段及器官特異性限制;結(jié)果穩(wěn)定、可靠;DNA需要量大,檢測(cè)技術(shù)繁雜,難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。1980年Wyman等發(fā)現(xiàn)了在未知的物理圖譜位置存在高度可變的多等位基因位點(diǎn)。Jeffreys在分析球蛋白基因家族的myoglobin時(shí)發(fā)現(xiàn)在其基因內(nèi)部有一個(gè)小衛(wèi)星DNA序列,并且它們的重復(fù)特征和其他基因中發(fā)現(xiàn)的序列具有相似性。然后Jeffreys用這些發(fā)現(xiàn)的小衛(wèi)星序列來(lái)篩選人類基因組文庫(kù),分離得到了其它的一些可變基因座。測(cè)序后發(fā)現(xiàn):這些小衛(wèi)星序列共有一個(gè)10-15bp的基序(motif)。Jeffreys又利用southernblotting的方法將這些小衛(wèi)星序列和來(lái)自不同物種的基因組DNA片斷進(jìn)行雜交,發(fā)現(xiàn)甚至在一個(gè)家庭中這些DNA的特征也是高度可變的。VNTR’s
和DNA指紋數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性
(
Variblenumberoftandemrepeats,VNTR)VNTR—一類叫小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA),其核心序列長(zhǎng)11~16bp,多存在于異染色質(zhì)區(qū)域(如端粒、隨體、基因非編碼區(qū));另一類叫微小衛(wèi)星DNA或微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA),其核心序列長(zhǎng)僅2~5bp,故亦稱為STR(短串聯(lián)重復(fù),shorttandemrepeat),廣泛分布于基因組中。凡是核心序列相同的VNTR屬于一種VNTR,盡管它們的長(zhǎng)度、重復(fù)次數(shù)和分布位點(diǎn)可能不一樣。英國(guó)的遺傳學(xué)家AlecJeffreys在進(jìn)行肌紅蛋白的DNA序列研究時(shí),意外發(fā)現(xiàn)非功能DNA(不產(chǎn)生蛋白的DNA)上重復(fù)著一種小片段DNA,這一含15個(gè)左右堿基的DNA片段,在不同個(gè)體間重復(fù)的頻率及位置有明顯的不同
VNTR的主要特點(diǎn)在人群中呈現(xiàn)出高度的多態(tài)性,即不同的人,同一種VNTR在染色體上的分布、數(shù)目和長(zhǎng)度不盡相同。對(duì)于每一個(gè)個(gè)體來(lái)說(shuō),其VNTR的組成與分布卻相對(duì)穩(wěn)定(無(wú)論是在體細(xì)胞還是在生殖細(xì)胞中)。呈孟德爾共顯性遺傳。DNA指紋技術(shù)的應(yīng)用親子鑒定(VNTR)
親子鑒定風(fēng)行意大利(幾十萬(wàn))現(xiàn)代家庭“情流感”
犯罪分析血液、唾液、頭發(fā)、精液和其他出現(xiàn)在犯罪現(xiàn)場(chǎng)的樣品成為嫌疑犯被監(jiān)禁或釋放強(qiáng)有力的證據(jù)誤差率在百萬(wàn)分之一以下,結(jié)果非常精確。
DNA身份證
DNA指紋技術(shù)讓你能擁有一張獨(dú)一無(wú)二的真正意義上的個(gè)人識(shí)別身份證。個(gè)人DNA基因身份證
southernblotting和DNA指紋技術(shù)的發(fā)明者(Edwin
Southern和AlecJJeffreys)在2005年因其發(fā)現(xiàn)的重要意義獲得了有醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)之稱的lasker獎(jiǎng)。
(二)染色體原位雜交(insituhybrisization)染色體原位雜交技術(shù):DNA探針與染色體上的DNA雜交,并在染色體上直接進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記技術(shù)。熒光素標(biāo)記的原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization,F(xiàn)ISH):利用與熒光素偶聯(lián)的單克隆抗體與抗原標(biāo)記的探針?lè)肿犹禺愋缘慕Y(jié)合來(lái)檢測(cè)DNA序列在染色體上的位置。基本步驟:制備探針—染色體制片—染色體處理與變性—染色體與探針雜交—顯微檢測(cè)。特點(diǎn):簡(jiǎn)便,結(jié)果直觀;靈敏度和分辨率依賴于制片技術(shù)和觀察設(shè)備。用作植物染色體原位雜交的探針因研究目的不同有許多種,主要的有:用于物種起源和親緣關(guān)系研究的物種專化DNA序列或外源物種總基因組DNA;用來(lái)構(gòu)建染色體物理圖譜的低拷貝或單拷貝序列;用于轉(zhuǎn)基因植物鑒定的含目的基因的BAC和YAC克隆。熒光原位雜交果蠅唾液染色體第二節(jié)以PCR反應(yīng)為核心的分子標(biāo)記單引物PCR標(biāo)記3’端具有選擇性的雙引物PCR標(biāo)記基于特異雙引物PCR的標(biāo)記類型隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RandomamplificationpolymorphismDNA,RAPD標(biāo)記)簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記(Simplesequencerepeat,
SSR標(biāo)記)—錨定PCR(SSR—anchoredPCR)標(biāo)記序列特征化擴(kuò)增區(qū)域(Sequencecharacteredamplifiedregion,SCAR標(biāo)記)AP-PCR(Arbitary
PrimedPCR)(引物10~50個(gè)堿基)DAF(DNA
Amplification
Fingerprinting)(引物短至5bp)SPARs(SinglePrimerAmplication
Reactions)標(biāo)記單引物PCR標(biāo)記3’端具有選擇性的雙引物PCR標(biāo)記擴(kuò)展片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP標(biāo)記)基于特異雙引物PCR的標(biāo)記真核生物基因組中的小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性,依據(jù)這些DNA序列設(shè)計(jì)雙引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生新的遺傳標(biāo)記。例如:AMP-FLPs(Amplified-Fragment
LengthPolymorphismsRAPD—用隨機(jī)引物進(jìn)行基因組DNA的PCR擴(kuò)增,電泳分離擴(kuò)增片段,得到隨機(jī)擴(kuò)增的多肽性DNA片段圖譜。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變,就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化,導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。增加或缺少的PCR產(chǎn)物則為RAPD標(biāo)記。隨機(jī)擴(kuò)增多肽性DNA標(biāo)記
(RandomamplificationpolymorphismDNA,RFLP)1990,Williams,etal.found.無(wú)需DNA探針,無(wú)需知道序列的全部信息;技術(shù)簡(jiǎn)便;DNA樣品需要量少,成本低;實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差,結(jié)果可靠性低;存在共遷移問(wèn)題。RAPD標(biāo)記的主要特點(diǎn)簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記
(Simplesequencerepeat,SSR)
SSR—根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的保守單拷貝序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,通過(guò)PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來(lái),利用電泳分析技術(shù)可獲得其長(zhǎng)度多肽性。1991,Moore,etal.found.微衛(wèi)星(microsatellite)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplesequencerepeats,縮寫SSR),STMS(Sequence-taggedmicrosatellites),SSRP(SimpleSequenceRepeatPolymorphisms):
重復(fù)單位含有1-5個(gè)堿基(也有2-8個(gè)堿基)組成的基序(motif)串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列,其長(zhǎng)度一般較短,廣泛分布于基因組的不同位置,如(CA)n、(AT)n、(GGC)n等重復(fù)。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性,導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性,這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。1989,Litt&Luty:Microsatellite主要特點(diǎn)廣泛分布于整個(gè)基因組,數(shù)量豐富;具有較多的等位性變異;共顯性標(biāo)記,可鑒別出雜合子和純合子;實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,結(jié)果可靠;由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需知道重復(fù)序列兩端的序列信息,可以在其它鐘的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢,否則就必須先建立含有微衛(wèi)星的基因組文庫(kù),再?gòu)闹泻Y選可用的克隆,進(jìn)行測(cè)序,然后設(shè)計(jì)合適的引物。常用的分子標(biāo)記特性比較CharactersRFLPRAPDAFLPSSR分布普遍普遍普遍普遍可靠性高中等高高重復(fù)性高中等高高遺傳性共顯性顯性顯性或共顯性共顯性多態(tài)性中等高非常高高DNA需求2-30ng1-100ng100ng50-100ng放射性一般有無(wú)有或無(wú)無(wú)技術(shù)難度中等簡(jiǎn)單中等簡(jiǎn)單樣品生產(chǎn)率中低高非常高高時(shí)間因素長(zhǎng)快中等快探針類型低拷貝DNA或cDNA克隆隨機(jī)序列特異DNA序列特異DNA重復(fù)序列探測(cè)部分低拷貝編碼區(qū)域整個(gè)基因組整個(gè)基因組整個(gè)基因組檢測(cè)位點(diǎn)1-31-1020-1001-5第三節(jié)新型的分子標(biāo)記單核苷酸多肽性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressedsequencestags,EST)單核苷酸多肽性
(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)同一位點(diǎn)的不同等位基因之間常常只有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的差異,因此在分子水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行檢測(cè)是很有意義的。目前SNP作為一種新的分子標(biāo)記,已有2000多個(gè)標(biāo)記定位于人類染色體上,在植物上也在進(jìn)行開發(fā)研究。檢測(cè)SNP的最佳方法是新近發(fā)展起來(lái)的DNA芯片技術(shù)。SNP發(fā)展背景第一張人類基因組序列正式圖于2003年4月完成。但序列圖只基于少數(shù)個(gè)體,它反映了基因組穩(wěn)定的一面,并未反映其變異或多態(tài)的一面,而正是這種多態(tài)性,即基因組序列的差異構(gòu)成了不同個(gè)體與群體對(duì)疾病的易感性、對(duì)藥物與環(huán)境因子不同反應(yīng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。人類基因組中存在廣泛的多態(tài)性,最簡(jiǎn)單的多態(tài)形式是發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代,即單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)。
SNP通常是一種二等位基因的(biallelic),即二態(tài)的遺傳變異,在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁。在轉(zhuǎn)錄序列上的SNP稱為cSNP。SNP的數(shù)量大、分布廣。按照1%的頻率估計(jì),在人類基因組中每100~300個(gè)核苷酸就有一個(gè)SNP。因此,整個(gè)人類基因組(3.2X109bp)中至少有1,100萬(wàn)以上的SNPs,在任何已知或未知基因內(nèi)和附近都可能找到數(shù)量不等的SNP。隨著分子遺傳學(xué)的進(jìn)展,疾病遺傳學(xué)研究從簡(jiǎn)單的單基因疾病轉(zhuǎn)向于復(fù)雜的多基因疾病(如骨質(zhì)疏松癥、糖尿病、心血管疾病、精神性紊亂、各種腫瘤等)與藥物基因組學(xué)的研究中。任一基因的多態(tài)性對(duì)疾病發(fā)生僅起微弱的作用。需要在人類基因組中找到一種數(shù)目多、分布廣泛且相對(duì)穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記。SNP作為遺傳標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)
SNP自身的特性決定了它比其它兩類多態(tài)標(biāo)記更適合于對(duì)復(fù)雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識(shí)別等方面的研究。國(guó)外的SNP研究國(guó)際SNP研究組織TSC(TheSNPConsortium)
與國(guó)際人類基因組測(cè)序組織(theInternationalHumanGenomeSequencingConsortium)共同報(bào)道了人類因組中1.42百萬(wàn)個(gè)SNPs
,使SNP的密度達(dá)到1/1.9kbSachidanandam等估計(jì)約60,000SNPs位于外顯子區(qū)域,這張高密度的SNP圖譜將有助于發(fā)現(xiàn)那些對(duì)疾病診斷與治療有益的重要基因。截止2001年5月,已有2.84百萬(wàn)存放在NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)dbSNP
中
國(guó)內(nèi)的SNP研究應(yīng)用變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)對(duì)冠心病患者的脂蛋白脂酶基因的SNP進(jìn)行了篩查;復(fù)旦大學(xué)遺傳所報(bào)道了漢族人群中腎上腺素能受體基因的SNP;上海人類基因組研究中心將DHPLC與直接測(cè)序法在SNP檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了比較研究,證明前者可有效地篩檢人類基因組中的SNP。表達(dá)序列標(biāo)簽
(Expressedsequencestags,EST)
EST技術(shù)直接起源于人類基因組計(jì)劃
原理:提取生
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