第三章細胞生物學研究方法第一節細胞形態結構的觀察方法第二節細胞及其組分的分析方法第三節細胞培養與細胞工程第四節細胞及生物大分子的動態變化第五節模式生物與功能基因組的研究第一節細胞形態結構的觀察方法一、光學顯微鏡二、電子顯微鏡三、掃描隧道顯微鏡一、光學顯微鏡技術☆基本構造：光學放大系統、照明系統、機械和支架系統普通光學顯微鏡成像原理物鏡得到物體放大的實像;目鏡把物鏡成的像進一步放大。顯微鏡和顯微技術幾個基本概念：放大分辨率反差能辨別兩點之間最小距離的能力與顯微鏡的自身特點有關，但也取決于進行顯微觀察時對顯微鏡的正確使用及良好的標本制作和觀察技術，這就是顯微技術。被觀察物區別于背景的程度被觀察物越小，放大倍數應越大，否則難以看清！決定光學顯微鏡的分辨率的要素

D＝0.61λ∕［N·sin(α/2)］D:分辨率λ：入射光的波長N：介質的折射率（1或1.5）α：物鏡的鏡口角（一）普通復式光學顯微鏡分辨率指區分開兩個質點間的最小距離。兩個質點之間的距離取決于光源波長λ

，物鏡鏡口角a和介質折射率ND=0.61λ/N×sin(a/2)空氣（N=1.0）、水（N=1.33）、香柏油（N=1.52）顯微鏡的種類及原理普通光學顯微鏡光學顯微鏡一般配置的最大放大倍數是多少？為什么？如何實現光學顯微鏡一般配置的最大放大倍數？其原理？目鏡：10~15×；物鏡：100×；總放大倍數1000~1500×；使用油鏡，即在100×物鏡和載玻片之間滴加香柏油；普通光學顯微鏡分辨率與所用波長成反比！用浸沒油取代空氣的作用?介質折射率提高分辨率得到提高改變光折射角度增加照明亮度很多原來由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。浸沒油與玻璃的折射率相近Makingtissuesections.Howanembeddedtissueissectionedwithamicrotomeinpreparationforexaminationinthelightmicroscope.普通光鏡的觀察取材－固定－脫水－包埋－切片－脫蠟－復水－染色－脫水－透明－封片－觀察步驟：觀察結果（二）熒光顯微鏡技術是光鏡水平對特異蛋白質等生物大分子定性定位的最有力的工具。主要是用于檢測細胞上的特異熒光材料；與普通光學顯微鏡不同的是增加了兩套濾光片。

第一套稱為激發光濾片，裝在光源和樣品之間，只有那些能激發熒光材料發光的特定波長的光才能通過。第二套稱為阻斷濾片，裝在物鏡和目鏡之間，只讓燃料所發出的熒光通過。在黑暗背景的襯托下，發出熒光的樣品很容易被觀察。Theopticalsystemofamodernfluorescencemicroscope.Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroic(beam-splitting)mirror(2).Inthisexamplethefiltersetfordetectionofthefluorescentmoleculefluoresceinisshown.熒光顯微鏡的光路圖Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.熒光染料分子熒光顯微鏡的應用B：不同熒光素所需激發波長與所產生的熒光波長比較C：細胞有絲分裂中期的觀察。熒光顯微鏡觀察真菌的細胞核MDFA/4d/DAPIstain(400×)WT?cdc15CM由于熒光顯微鏡的暗視野為熒光信號提供了強反差背景，非常微弱的熒光信號亦可得以分辨。（三）激光共焦點掃描顯微鏡特點：排除焦平面以外光的干擾，增強圖像反差和提高分辨率(1.4-1.7)，可重構樣品的三維結構,主要用來研究細胞亞結構。激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）：

用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。激光掃描共焦顯微鏡的原理圖原理：激光束經雙色鏡反射后，通過物鏡聚集到樣品某一焦點；從焦點發射的熒光經透鏡匯聚成像，被檢測出；其他部位發射的熒光不聚焦成像，不能檢測到。熒光顯微鏡（A）和激光掃描共焦顯微鏡（B）所觀察圖像的比較小鼠腎小球的厚切片Figure3-14.Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

一種將相位差轉變成振幅差（明暗差）的顯微鏡，可觀察不染色的活細胞。利用樣品的不同位點的密度差，形成肉眼可見的明暗區別。微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）

一種將樣品厚度上的微小區別轉化成明暗區別相差顯微鏡。錄像增差顯微鏡技術（video-enhancemicroscopy）（四）其它光學顯微鏡相差顯微鏡觀察真菌菌絲2dWT?cdc15CM3d兩種不同類型的光學顯微鏡所拍攝的圖像比較體外培養的MDCK細胞的圖像A:普通顯微鏡所拍B：相差顯微鏡所拍二、電子顯微鏡（一）、電子顯微鏡的基本知識

1.電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區別

2.電子顯微鏡的分辨本領與有效放大倍數

3.電子顯微鏡的基本構造（二）、主要電鏡制樣技術

1.超薄切片技術

2.負染色技術

3.冷凍蝕刻技術

4.電鏡三維重構與低溫電鏡技術

5.掃描電鏡技術二、電子顯微鏡技術電子顯微鏡的基本結構（A）和成像原理（B）電子顯微鏡與光學顯微鏡的區別

顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差主要區別（1）光源不同光鏡為可見光或紫外線；電鏡為電子束（2）透鏡不同光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡（3）真空系統（4）顯示記錄系統超薄切片技術固定、脫水、包埋、切片、染色。基本要求：細胞精細結構保存良好，不產生明顯的物質凝聚、丟失或添加人工效應等；切片厚度在500埃左右，最大不超過1000埃（1mm厚的樣品切成20000片；一個一般大小的細胞要切成300片）切片應耐受電子束的轟擊，包埋介質不發生變形；切片應具有良好的反差；切片需均勻，沒有皺褶、刀痕及染色劑沉淀等缺陷。SpecimenPreparationforElectronMicroscopyThinSectioningforTEMThewaxsections:3-10um;ThePlasticultrathin-sectionsforTEM:40-50nmSectionsofLM:>5um;SectionsofTEM:<100nm

電鏡超薄切片樣本制備示意圖Figure3-20.Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.超薄切片技術顯示的動物細胞超微結構家蠶細小病毒負染色電鏡照片（病毒直徑20nm）II.Scanningelectronmicroscope(SEM)

ImagesofsurfacescanbeobtainedbySEM;Critical-pointdrying;Range:15－150,000X.Resolution:5nmFigure3-23.Scanningelectronmicroscopy.Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Forcomparison,thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).

Figure3-32.Cellsinculture.Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.掃描電鏡原理示意圖（A），掃描電鏡下可清晰地顯示原生動物四膜蟲表面的纖毛和口器（B）三、隧道掃描顯微鏡原理：掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時，即產生彼此間相互作用力，如量子力學中的隧道效應（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計算機顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。特點：（1）可對晶體或非晶體成像，無需復雜計算，且分辨本領高。（側分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達0.01nm）； （2）可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量； （4）可連續成像，進行動態觀察。用途：納米生物學研究領域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結構。幾種顯微鏡可觀察的樣品大小（箭頭之間的范圍）及其分辨能力（右側箭頭所指位置）分辨率：能區分開兩個質點間的最小距離眼睛、光學顯微鏡和電子顯微鏡的分辨率分別為：0.2mm、0.2μm和0.2nm。第二節細胞及其組分的分析方法一、用超離心技術分離細胞組分二、細胞成分的細胞化學顯示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性四、細胞內特異核酸的定位與定性五、定量細胞化學分析與細胞分選技術一、用超離心技術分離細胞組分用差速離心法分離細胞勻漿中的各種細胞組分用密度梯度離心分離細胞組分示意圖用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。二、細胞成分的細胞化學顯示方法為了測定蛋白質、核酸、多糖和脂質等細胞組分，通常利用一些顯色劑與所檢測物質中一些特殊基團特異性結合（反應）的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分布和相對含量。A:直接免疫熒光標記技術：利用偶聯熒光分子的抗體與細胞或細胞切片進行孵育，使抗體和相應抗原結合，在熒光顯微鏡下對抗原進行定位的技術。B:間接免疫熒光標記技術：即不帶熒光標記的第一抗體與相應抗原孵育形成復合物后，再用熒光標記的第二抗體識別第一抗體，從而顯示抗原所在位置。

三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫膠體金電鏡原位雜交技術的基本原理與應用（膀胱上皮細胞膜蛋白的分布：箭頭所指）四、細胞內特異核酸的定位與定性原位雜交（insituhybridization）：通過單鏈RNA或DNA探針對細胞或組織中的基因或mRNA進行定位的技術。

用原位雜交技術顯示Z13基因在受精后1d的斑馬魚胚胎的體節、眼和松果體中的表達（箭頭所指）五、定量細胞化學分析與細胞分選技術流式細胞術：一種用于核酸、蛋白質、染色體和細胞等的定量、分離和分選的技術。流式細胞儀的工作原理第三節細胞培養與細胞工程一、細胞培養二、細胞工程一、細胞培養

原代培養：用直接從生物體獲得的細胞所進行的培養的過程。

傳代培養：對原代培養的細胞進行分割，重新接種進行再培養的過程。細胞系：來源于動物或植物細胞，能夠在體外培養過程中連續增殖的細胞群體。動物細胞培養A：正在生長分裂的HeLe（宮頸瘤）細胞B:長滿單層的CHO（中國倉鼠卵巢）原代細胞植物細胞培養單倍體細胞培養原生質體培養

二、細胞工程細胞融合：兩個細胞通過質膜的接觸并相互融合形成一個細胞的過程。融合后的細胞只有一個連續的細胞質膜。單克隆抗體：單個細胞克隆所合成針對一種抗原決定簇的抗體。雜交瘤技術：由一個正常的產生抗體的B淋巴細胞與一個惡性骨髓瘤細胞融合產生的雜種細胞系。具有無限增殖和產生單克隆抗體的特性。細胞拆合：即先把細胞核與細胞質分離開來，然后把不同來源的核體和胞質體相互融合，形成核-質雜交細胞。單克隆抗體制備過程體外培養應用顯微注射技術進行細胞核移植細胞拆合第四節細胞及生物大分子的動態變化一、熒光漂白恢復技術二、單分子技術與細胞生命活動的研究三、酵母雙雜交技術四、熒光共振能量轉移技術五、放射