PCR檢測技術及其應用現代生物學檢測技術什么是PCR技術？PCR(polymerasechainreaction),即聚合酶鏈反應。它是體外模擬DNA復制的過程，以單鏈DNA為模板，以人工設計的寡核苷酸為引物，利用穩定的聚合酶，摻入單核苷酸來特異地擴增DNA片段的技術。什么是PCR技術？反應特點：特異性強；靈敏度高；簡便、快速；對標本的純度要求低DNA復制過程簡述請課前準備的同學進行講解。PCR反應原理PCR檢測分三個步驟：1是PCR擴增模板的制備，也就是病原微生物基因

組提取2是PCR擴增，即目的基因特異擴增過程（最重要的步驟）3是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下檢測基因片

段重點步驟：PCR擴增期（觀看動畫）PCR擴增期包括變性－退火－延伸三個基本反應步驟：模板DNA的變性：加熱至94-96℃，模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA離解成為單鏈；模板DNA與引物的退火（復性）：溫度降至50-65℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，合成一條與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。

72℃

重復變性－退火－延伸三個過程，目的基因被擴增放大幾百萬倍。每個循環需2-4min，整個PCR反應需要2-3h。問題思考：聚合酶在催化引物延伸的反應中在下一循環的加熱變性中會失活，導致循環都要加一次酶？怎么解決？

1988年初，Keohanog通過對所使用的酶的改進，提高了擴增的真實性。而后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術的擴增效率大大提高，叫做TaqDNA聚合酶。PCR的實驗室檢測觀看操作視頻檢測過程：設計引物---擴增---檢測PCR的檢測過程PCR擴增體系主要包括：引物 PCR反應介導物DNA模板

被擴增目的物耐熱DNA聚合酶 PCR反應催化劑dNTPs 反應底物緩沖液

提供反應環境鎂離子

耐熱DNA聚合酶活性依賴離子PCR產物的檢測1、凝膠電泳：EB（溴化乙錠）可鑲嵌在DNA片段中，并在一定波長的紫外線下發射出橘紅色的可見光。在凝膠介質中不同大小的PCR片段在一定電壓下的遷移率不同，從而在凝膠中呈現出不同的亮線。缺點：只能對終產物進行分析，無法對起始模版準確定量；必須在擴增反映結束后借助電泳方法分析，費時費事；無法對擴增反應實時檢測；EB有毒Marker是人為的把一系列已知大小的DNA（或已知質量的蛋白，當然PCR中用的是DNAmarker不是蛋白marker）混合在一起，在電泳的時候對照用。PCR產物的檢測2、熒光PCR：反應體系中在PCR過程中利用熒光染料在光刺激的情況下釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產物量的變化。優點：無需PCR后電泳處理，儀器在線實時檢測，避免人為判斷，利用自動化和聯網管理。觀看熒光PCR檢測視頻PCR分類1、多重PCR技術（P170）常規一對引物擴增，只產生一個特異的DNA片段。若有十分龐大的基因序列需要檢測，超過了PCR擴增DNA片段的長度，則采用常規PCR就需要分段進行多次擴增，費時費力。常用于轉基因食品檢測。PCR分類2、實時熒光定量PCR技術（P171）視頻在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現了實時監測整個PCR進程，對起始模板進行定量分析的方法。與普通PCR的區別普通PCR技術：在PCR結束后對終點產物進行定量分析。實時定量PCR技術：實時檢測PCR擴增，在擴增的指數期對起始模板進行定量。PCR檢測所需要的儀器設備（1）、PCR實驗室

PCR只需幾個DNA分子作模板就可大量擴增，應注意防止反應體系被痕量DNA模板污染和交叉污染，這也是最容易造成假陽性原因之一。實驗室布局應重點考慮避免這種污染。因此用于PCR檢測的實驗室要進行功能區域劃分，從對環境要求的嚴格程度和功能上可將PCR整個實驗流程劃分為四個區域：1.配液區（準備區）2.模板提取區3.PCR擴增區4.電泳區（二）實驗器材必須使用PCR專用吸頭試劑盒的運輸和貯存PCR試劑盒在適當的貯存溫度下的有效期一般為6個月核酸擴增部分的試劑一般要貯存于-20℃產物檢測部分試劑則貯存于2～8℃。電泳槽、電泳儀的圖片凝膠成像系統的圖片觀看視頻，回憶PCR實驗室檢測步驟1是PCR擴增模板的制備，也就是病原微生物基因組提取2是PCR擴增，即目的基因特異擴增過程3是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下檢測基因片段PCR檢驗技術在食品工業中的應用一、在食品致病微生物檢測中的應用（P173）檢測沙門氏菌、產單核細胞李斯特菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等。二、在食品轉基因成分檢測中的應用（補充）抗蟲害、抗病毒、抗雜草的轉基因玉米、黃豆、油菜、土豆、西葫蘆等。李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)（P173）對牛奶等食品均有不同程度的污染,是食品中的主要病原菌。傳統的檢測方法存在周期長、操作繁瑣等不足之處。在食品致病微生物檢測中的應用（P173）PCR法：1）提取總DNA；2）根據LM的保守序列設計引物特異地PCR擴增。優點：對其它菌不產生反應，顯示了較強的特異性；

檢測的敏感性非常高；檢測只需要5～6h,較之傳統方法快得多。通過對TaqDNA聚合酶和引物濃度等條件的優化，建立簡便實用的快速檢測牛奶中LM菌的試劑盒，具有良好的應用前景。在食品轉基因成分檢測中的應用轉基因食品（geneticallymodifiedfoods,GMF)是由細胞DNA中經非生殖方法插入了特定外源基因或基因片段，并獲得某種良好性狀的動物