離子束輻照誘變細菌纖維素生產菌株研究陜西科技大學學生：劉東文指導老師：張雯專業：制藥工程學號：201004040207畢業答辯研究背景細菌纖維素（BacterialCellulose,BC）BC的獨特性質BC生產菌株—木醋桿菌離子束輻照誘變的優勢目的及意義研究內容離子束輻照誘變條件的確定篩選體系的建立菌株的誘變突變菌株的篩選突變菌株的遺傳穩定性研究突變菌株的材料學特性研究壹離子束輻照誘變條件的確定菌體細胞的收集

5mL種子液固體培養基平板上30℃靜態培養24h菌膜移取至裝有10mL無菌水和玻璃珠的100mL三角瓶振蕩培養箱（200r/min，30℃）中振蕩培養1h使菌體細胞充分混勻菌膜移取至裝有10mL無菌水和玻璃珠的100mL三角瓶離子束輻照誘變條件的確定“1”代表只抽真空的菌株的固體培養基平板；“7”代表離子注入劑量為32×1014N+/cm2的菌株的固體培養基平板；“9”代表離子注入劑量為47×1014N+/cm2的菌株的固體培養基平板；“11”代表離子注入劑量為67×1014N+/cm2的菌株的固體培養基平板；“12”代表離子注入劑量為70×1014N+/cm2的菌株的固體培養基平板。離子束輻照誘變條件的確定選擇41×1014N+/cm2

的劑量進行輻照誘變。貳固體培養基平板-96孔板-試管篩選體系的建立篩選體系的建立根據觀察固體培養基平板上的菌落特征來進行固體培養基平板初篩；所以選用96孔板進行初次復篩；為了得到更準確的結果，要對菌株產品進行檢測，所以用試管進行二次復篩。叁菌株的誘變菌株的誘變操作臺真空室真空泵肆突變菌株的篩選突變菌株的篩選固體培養基平板初篩96孔板復篩試管復篩固體培養基平板初篩固體培養基平板初篩將固體培養基平板上菌落篩入96孔板。第1列是對照菌株，第2、3、4、5、6、7列是選取顏色較為發白且菌落生長迅速的菌落，第8、9、10、11、12列是選取表面水潤光滑的菌落。96孔板復篩96孔板復篩

因為細菌纖維素膜是木醋桿菌的初級代謝產物，所以根據膜的生長快慢及膜的基本形態可以做出篩選。根據所建立的固體培養基平板-96孔板-試管篩選體系，得到96孔板初次復篩所選出的50株菌株為：2G、3D、4F、6C、8D、5E、1B、6A、4E、11G、7H、3A、6G、5A、11E、10B、2D、2E、5D、10A、8G、1E、5G、6D、9B、7B、11C、8B、10G、10C、6F、3G、1G、4A、5F、8E、3E、6E、11F、8F、9A、5C、3H、11D、9H、4B、2C、2B、1D、7A.試管復篩從左到右四張圖片依次代表“菌株4E”、“菌株5E”、“菌株11E”和“菌株2G”試管復篩時的BC膜生長狀態，試管后面試管架上為其余菌株試樣。試管復篩以產量為先決篩選條件，選取2D、2E、3D、4E、5A、5D、5E、5G、11E作為優良變異菌株，以1B、1G作為對照菌株。試管復篩

2D產量提高303.3%，持水率提高8.37%，2E產量提高201.1%，持水率提高7.9%，3D產量提高125.4%，持水率提高12.2%，4E產量提高138.1%，持水率提高10.42%，5A產量提高87.3%，持水率提高8.89%，5D產量提高334.9%，持水率提高7.59%，5E產量提高141.2%，持水率提高10.6%，5G產量提高306%，持水率提高4.87%，11E產量提高112.7%，持水率提高8.61%。伍突變菌株的遺傳穩定性研究突變菌株的遺傳穩定性研究標號產量/g·L-1提高百分比持水率持水率提高百分比復水率復水率提高百分比1B1.013-1.33%94.81%0.00%89.59%0.00%1G1.0270.00%95.12%0.33%89.23%-0.40%2D1.66061.64%94.58%-0.25%79.42%-11.35%2E2.227116.81%95.25%0.46%82.96%-7.40%3D1.62057.74%96.16%1.42%84.32%-5.88%4E1.94088.90%94.63%-0.19%84.76%-5.39%5A2.973189.52%93.02%-1.89%85.75%-4.29%5D3.473238.20%95.88%1.13%89.64%0.06%5E2.987190.81%93.02%-1.89%84.97%-5.16%5G1.81376.57%95.57%0.80%89.70%0.12%11E3.220213.53%92.50%-2.44%79.71%-11.03%突變菌株的遺傳穩定性研究標號產量/g·L-1提高百分比產量持水率持水率提高百分比復水率復水率提高百分比1G0.470%96.67%0%94.74%0%2D1.7373.33%94.05%0.65%77.39%-12.77%2E2.07107.33%95.35%2.04%84.53%-4.72%3D1.6060.00%95.99%2.72%84.83%-4.38%4E2.27126.67%91.97%-1.58%81.91%-7.67%5A2.85184.67%92.23%-1.30%85.57%-3.54%5D3.47246.67%95.77%2.48%90.10%1.55%5E3.20220.00%91.95%-1.61%85.59%-3.53%5G1.8786.67%95.31%1.99%89.35%0.71%11E3.67266.67%89.59%-4.13%77.73%-12.38%突變菌株的遺傳穩定性研究標號產量/g·L-1提高百分比產量持水率持水率提高百分比復水率復水率提高百分比1G0.53-46.67%96.21%0%93.98%2D1.7979.33%93.85%0.43%77.01%-13.20%2E2.74174.00%93.93%0.51%80.52%-9.24%3D1.6060.00%96.06%2.79%84.92%-4.27%4E2.27126.67%92.16%-1.38%81.91%-7.67%5A2.85184.67%92.23%-1.30%85.53%-3.60%5D3.47246.67%95.85%2.56%90.13%1.59%5E3.13213.33%92.26%-1.28%85.89%-3.19%5G1.9393.33%95.14%1.81%89.02%0.33%11E3.47246.67%90.22%-3.46%78.95%-11.02%突變菌株的遺傳穩定性研究

實驗結果表明，遺傳穩定性較差的菌株是2E，產量第一代為2.07g/L，第二代產量為2.27g/L，第三代產量為2.74g/L.其他菌株遺傳穩定性良好，如5A、5D、5E，從產量上來分析：5A基本上維持在2.85g/L,5D產量基本上維持在3.47g/L左右，5E基本上維持在3.15g/L左右。所以，除了菌株2E,總體遺傳較為穩定。陸突變菌株的材料學特性研究電鏡掃描菌株1B發酵生產BC膜SEM圖譜

菌株5D發酵生產BC膜SEM圖譜

電鏡掃描菌株3D發酵生產BC膜SEM圖譜

菌株5G發酵生產BC膜SEM圖譜電鏡掃描

相比于對照菌株1B,韌性優良的菌株5D表面致密，截面纖維較粗；持水性能較好的菌株3D結構相對松散，纖維比較纖細；復水性能優良的5G表面結構致密，但從截面觀察，纖維層之間比較松散。結論菌體細胞的收集及菌體細胞濃度的確定為離子束輻照誘變提供了的前提條件；確定了最佳誘變劑量41×1014N+/cm2；建立了固體培養基平板—96孔板—試管篩選體系，最終篩選到9株目標突變菌株；除了菌株2E,總體遺傳較為穩定。