人類后基因組研究進展隨著人類基因組計劃(HGP)的順利進行，生物醫學研究已進入后基因組時代(Postgenomeera)［1］。基因組學的研究從結構基因組學(Structuralgenomics)過渡到功能基因組學(Functionalgenomics)。結構基因組學代表基因組分析的早期階段，這個階段以建立生物體高分辨遺傳、物理和轉錄圖譜為主。而以功能基因組學為代表的后基因組時代是利用結構基因組學提供的信息，系統的研究基因功能。它以高通量、大規模實驗方法及統計與計算機分析為特征［2］。8～10萬個基因的功能研究比HGP更為復雜和艱巨，必將成為下個世紀生命科學研究的主戰場。后基因組研究涉及的主要內容及方法有：

1．生物信息學(Bioinformatics)

隨著人類基因組計劃(HGP)在世界范圍內的展開，產生了巨量的基因信息，分析這些信息是人類基因組研究必不可少的內容。這也促成了生物信息學的發展。生物信息學是用數理和信息科學的觀點、理論和方法去研究生命現象，組織和分析呈指數增長的生物學數據的一門學科。研究DNA和蛋白質，以計算機為主要工具，發展各種軟件，把基因組DNA序列信息分析作為源頭，在獲得蛋白質編碼區的信息之后進行蛋白質空間結構的模擬和預測，然后依據特定蛋白質功能進行必要的藥物設計。故此，生物信息學是由數據庫、計算機網絡和應用軟件三大部分組成，對基因組信息學、蛋白質結構模擬以及藥物設計的研究為主要目的的學科。結構基因組學提供了巨大的DNA和蛋白質數據，功能基因組學的一個任務就是如何充分利用數據庫去研究基因功能。

生物信息學在人類基因中的應用主要有：

(1)新基因的發現與鑒定

使用基因組信息學的方法是發現新基因的重要手段，比如在啤酒酵母完整基因組(約1200萬bp)所包含的5932個基因中，大約60%是通過信息分析得到的。

(2)非編碼區信息結構分析

雖然對約占人類基因組95%的非編碼區的作用人們還不清楚，但從生物進化的觀點看來，這部分序列必定具有重要的生物功能。普遍的認識是，它們與基因在四維時空的表達調控有關。應用生物信息學可以分類與確定非編碼區中各種組分、尋找新的非三聯體的編碼方式、研究編碼區和非編碼區中信息調節規律等三個方面來揭示非編碼區的秘密。

(3)對生物進化的研究

自1859年Darwin的物種起源(OriginofSpecies)發表以來，進化是對人類自然科學和自然哲學發展的最重大貢獻之一。自上世紀中葉以來，隨著分子生物學的不斷發展，進化論的研究也進入了分子水平，并建立了一套依賴于核酸、蛋白質序列信息的理論方法?，F在隨著序列信息的大量出現開展分子進化的研究具有了極好時機。

(4)完整基因組的比較研究

在后基因組時代，生物信息學家面對的不僅是序列和基因而是越來越多的完整基因組，由此而來的比較基因組學必須通過生物信息分析法采用現代手段來完成。

(5)大規模基因功能表達譜的分析

大規模基因功能表達譜的分析從數學角度看不是簡單的NP問題、動力系統問題或不確定性問題，目前發展的新方法和工具無論是生物芯片還是蛋白質組技術都更強烈地依賴于生物信息學的理論、技術與數據庫。

(6)藥物設計

傳統的藥物研制主要是從大量的天然產物，如動物、植物、微生物和合成有機、無機化合物中進行篩選。往往得到一個可供臨床使用的藥物要篩選1萬種不同的化合物，要經過10年左右的時間和耗資2.5～3.0億美元。當前生物信息學的研究不僅可提供生物大分子空間結構的信息，還能提供電子結構的信息，如能級、表面電荷分布、分子軌道相互作用等以及動力學行為的信息，如生物化學反應中的能量變化、電荷遷移、構象變化等。理論模擬還可研究包括生物分子及其周圍環境(如水、離子等)的復雜體系和生物分子的量子效應。這些模擬的結果為天然生物大分子的改性和基于受體結構的藥物分子設計提供了依據。

2．基因功能研究

人類后基因組計劃的關鍵點是基因的功能研究，這也是對功能基因加以開發利用研究的基礎。主要包括以下內容：

2.1

基因表達譜的繪制

基因表達ｍＲＮＡ的水平反映了在一定環境、細胞類型、生長階段和一定細胞狀態下基因的功能信息。因此繪制所有基因的表達譜非常重要。目前，科學工作者已相繼建立了ｍＲＮＡ差異顯示、代表性差異分析、抑制性消減雜交、基因表達系列分析和ｃＤＮＡ微陣列等技術。新近在綜合上述技術的優缺點的基礎上建立的基因鑒定集成法是具有充分利用生物基因信息數據庫進行基因鑒定(識別)，并能提高稀有拷貝基因鑒定效率的優點。

2.2

基因調控研究

基因表達調控是功能基因組學研究的主要內容之一，不同條件下基因表達譜的變化是基因組調控的結果。這種調控直接決定了不同組織細胞中蛋白質的變化，進而影響相應的生化代謝通路的作用，最終引起一定的表型變化。所以，欲研究某一特定基因的功能，就不能不研究其表達的調控方式和機理。此外，現已知道，許多模式生物基因組雖然在長度上比人類的少，但所包含的基因數基本一致，只是少了一些非編碼序列和在基因組中所處位置有所不同，這種差異造成他們表達譜的很大不同，因此，基因表達譜的差異是基因調控的不同之故。

2.3

模式生物體和比較基因組學研究

利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和組織結構上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機制，闡明物種進化關系，及基因組的內在結構，這便是比較基因組學。

所有生物都是通過一個共同的進化樹聯系在一起。因此研究一個生物可為其它生物提供有用的信息，其主要促進作用體現在：(1)利用基因順序上的同源性克隆人類疾病基因。(2)模式生物基因組研究揭示人類疾病基因。(3)充分利用模式生物實驗系統上的優越性來為最終了解人類基因服務。(4)模式生物基因組研究加深了對基因組結構的認識。(5)比較基因組作圖使連鎖信息和基因組資源從作圖較為詳盡的物種轉移到作圖不完善的物和用于復雜性狀的分析。

目前與人類基因組計劃同步進行的模式生物有E.coli、酵母、線蟲、果蠅和小鼠，還有一些與人類生活密切相關的哺乳動物。酵母作為第一個真核生物基因組于1996年完成ＤＮＡ測序;線蟲作為第一個多細胞生物基因組于1998年底完成測序。而果蠅、小鼠和其它模式生物的基因組也以驚人的速度在進行。大量數據的積累將使人類對于生命以及人類自身有嶄新的認識。

2.4

功能基因組學的研究方法

(1)誘變技術

定向誘變(targetedmutagenesis):定向誘變是利用同源重組技術，使胚胎干細胞(embryonicstemcell，EScell)內目的基因產生定點突變，這些突變可進一步用于基因敲除、轉基因動物、顯性負突變等研究。最近兩年發展了許多構建靶結構的新方法如釀酒酵母中微同源重組(microhomologousrecombination)，通過ＰＣＲ的方法產生一個特定的靶ＤＮＡ片段，這個片段含有一個兩側帶有與酵母基因同源的35～50bp作為選擇性標記，就足以促進酵母的同源重組，而在小鼠ＥＳ細胞中，至少需要19kb的連續基因組ＤＮＡ才能產生有效的同源重組。以往這種方法只用在酵母中，現在也用到小鼠上。

表型誘變(phenotypedrivenmutagenesis)定向誘變方法是用于已知基因的突變，而表型誘變是用于未知基因，其主要優點是無需知道哪個基因以及這些基因的何種突變導致特定的表型或疾?。?］。用表型誘變劑進行誘變后，可以用篩查整個基因組的辦法來尋找新的顯性或隱性突變。該方法需要大量的小鼠雜交群體，工作量較大，但這種全基因組掃描法是篩查整個基因組中單一突變的最好方法，因為任何一個導致一定表型的可能突變都可以被檢測出來。

(2)進化印記方法

基于生物的進化歷程必定會在分子序列上留下相應的進化印記，即家族特異模體和直系同源簇特異模體組成的功能特異模體。首先用嚴格的進化分析方法把基因家族劃分成各個直系同源簇，然后構建家族及每個直系同源簇的特異模體，借助已有的生物學事實，形成功能模體庫。每一個未知基因產物的功能就用搜索此功能模體庫來鑒定。

3．蛋白質組學研究(Proteomics)

由于生物功能的主要體現者是蛋白質，而蛋白質有其自身特有的活動規律，僅僅從基因的角度來研究是遠遠不夠的。蛋白質的修飾加工、轉運定位、結構形成、蛋白質與蛋白質的相互作用、蛋白質與核酸的相互作用等，均無法從在基因組水平上的研究獲知。1990年代中期，國際上萌發了一門在整體水平上研究細胞內蛋白質的組成及其活動規律的新興學科——蛋白質組學(Proteomics)。

蛋白質組(Proteome)的概念最早是在1994年由澳大利亞Macquarie大學的MarcWilkins和KeithWilliams首先提出來的。目前，美國、澳大利亞、歐洲和日本等已紛紛成立了有關的研究機構和公司，有人預測21世紀生命科學的重心將從基因組學轉移到蛋白質組學。蛋白質組學以蛋白質組為研究對象，從蛋白質整體水平上來認識生命活動的規律。蛋白質組學的核心內容包括兩個部分：蛋白質組研究體系的建立、完善和重要的生物學問題有關的功能蛋白質組研究［9］。

3.1

蛋白質組研究的主要手段

相對于基因組研究的進展速度，蛋白質組的研究顯得相對滯后，主要原因是研究手段中眾多技術問題尚未很好解決。從這幾年中對基因組全序列分析已經完成的一些低等生物蛋白質組的研究看來，目前最現實、最有效的技術是雙向凝膠電泳分離純化蛋白質，結合計算機定量分析電泳圖譜，并進一步用質譜對分離到的蛋白質進行鑒定，并運用現代生物信息學的知識和技術對所得到的天文數字的數據進行處理，對蛋白質以及它們執行的生命活動作出盡可能最精細、最準確、最本質的闡述［10］。當前蛋白質組的研究可分為兩個階段：第一階段是建立一個細胞或一個組織或一個機體在“正?！睏l件下的蛋白質二維凝膠圖譜，或稱參考圖譜，即所謂“組成蛋白質組”。第二階段則要研究在各種條件下的蛋白質組的變化，從中總結出生命活動的規律，可以稱為“功能蛋白質組”。

(1)雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳在1975年由O’Farrell以及Klose和Scheele等人發明，其原理是第一向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有實用價值的核心方法。

(2)“雙向”高效柱層析

所謂“雙向”高效柱層析，實際上是先進行一次分子篩柱層析，從柱上流出的蛋白峰自動進入第二向層析，通常是利用蛋白質表面疏水性質進行分離的反向柱層析［12］。這第二次分離的原理與雙向電泳中利用蛋白質等電點分離完全不同，因此兩種方法起到互相補充的作用。和雙向電泳相比，“雙向”高效柱層析的優點是可以適當放大，分離得到較多的蛋白量以供鑒定。另一個優點是流出的蛋白峰可以直接連通進入質譜進行鑒定，避免了“印跡”的步驟和因此引起的的缺點。

(3)質譜技術上面所說的兩種技術都是分離技術，而質譜則是鑒定技術。質譜技術的原理并不新鮮，但是在1980年代早期出現的兩種新的離子化技術，使質譜從僅能分析小分子揮發物質到可以研究生物大分子，1980年代末又發明了兩種更新的離子化技術，一種是介質輔助的激光解吸/離子化(matrix-assistedlaserdesorption/ionization，MALDI),另一種是電噴霧離子化(electrosprayionization，ESI)。這些技術使能快速而極為準確地測定生物大分子的分子量；再結合各種新的質譜分析技術，便可以在各種水平上研究蛋白質，為蛋白質研究開辟了新的道路，使蛋白質組研究從蛋白質鑒定深入到高級結構研究，以及各種蛋白之間的相互作用研究。可以預見，未來的質譜技術必將是從基因組到其功能的各級水平的蛋白質研究的主要工具。用質譜技術可以進行的從基因組到蛋白質功能的研究可以歸納為表1。

表1

用質譜技術可以進行的從基因組到其功能的蛋白質研究問題/任務有關的質譜技術在基因組，蛋白序列庫和EST序列庫用MALDI或ESIMS，ESIMS/MS中篩到的蛋白是已知蛋白嗎?MALDIPSD做肽譜，或做全蛋白的ESIMS/MS如未知，提供足夠的序列信息做克隆蛋白鑒定，二級修飾，二硫鍵，異構體(序列錯誤)ESIMS/MS，MALDIPSD分子量測定，再用MALDI或ESIMS或MS/S做肽譜高級結構:折疊，穩定性，單體或多聚體用ESIMS監測重氫交換，MALDI或ESIMS監測表面標記，非變性條件下ESIMS,MALDIMS監測交聯蛋白質何時和什么分子，怎樣相互作用?親和技術與MALDI或ESIMS結合，MALDI或ESIMS監測表面標記和有限水解

(4)生物信息學當前生物信息學已經不僅是高效地進行對基因組/蛋白組數據的分析，而且可以對已知的或新的基因產物進行全面的功能分析。例如用生物信息學對用質譜得到的肽指紋圖譜(peptidemassfingerprinting)數據分析出了一個新的在進化過程中保守的模序(motif),它對蛋白質的結構和功能具有重要意義。用分子模建(molecularmodelling)揭示了在耐熱菌Thermusaquaticus的肽延伸因子EFTu中的一個模序(340～345)對維持三個結構域之間的整體構象的完整性有重要意義。肽指紋圖譜原先只是一個普通的蛋白質分析技術，但通過生物信息學處理則可以得到有功能意義的結構信息，甚至預測部分蛋白質的功能。

3.2

蛋白質組研究的應用

蛋白質組研究在學術上的重大意義已如前述。同時，其研究成果還將在醫藥和工業上得到廣泛應用。對人類基因組在不同病理條件下所表達的蛋白質組的比較研究，和對一些致病細菌蛋白組的研究，將對了解疾病的原因和進行防治起到決定性的作用。現在肺病桿菌的基因全序列已經測定，蛋白組的研究也已開始進行［14］。心肌肥大癥的蛋白組研究也已經起動，發現了與肌肉收縮密切有關的一種肌球蛋白的過度表達。農業上，育種也將從現在的通過個別基因的轉移來改進個別性能，進人整體性能的改善。除人基因組外，有50多種生物的基因組分析已經完成或即將完成。一種在90℃生長的單細胞生物Aquifex的基因組的信息顯然將對新的工業用酶的開發作出貢獻，而病原體Staohylococusaureus基因組和蛋白質組的研究將發展新的抗菌素。可以預期蛋白質組研究必將對人類生活質量的提高和人的壽命的延長起巨大的作用。

4．基