3.2基因工程的基本操作程序-2新教材?人教版?選擇性必修三【教學過程】TeachingProcess1.概念圖3.教學總結、綜合2.課堂教

學內容4.課堂練習鞏固典型習題規律總結探究?實踐建立模型基本步驟1.轉化指目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程。2.轉化的受體細胞三.將目的基因導入受體細胞受體細胞將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法冠癭瘤農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，并誘導產生冠癭瘤等。2.轉化的受體細胞（1）將目的基因導入植物細胞①農桿菌轉化法三.將目的基因導入受體細胞為什么農桿菌容易感染雙子葉植物？科學研究發現，當植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農桿菌移向這些細胞，這時農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA（可轉移的DNA）轉移至受體細胞染色體的DNA上。這種酚類化合物主要在雙子葉植物細胞壁中合成，單子葉植物通常沒有。2.轉化的受體細胞（1）將目的基因導入植物細胞①農桿菌轉化法三.將目的基因導入受體細胞A.載體：B.受體細胞：農桿菌Ti質粒（T-DNA)主要是雙子葉植物和裸子植物農桿菌Ti質粒隨著轉化方法的突破，農桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。2.轉化的受體細胞（1）將目的基因導入植物細胞①農桿菌轉化法三.將目的基因導入受體細胞構建表達載體含目的基因的重組Ti質粒表現出新性狀的植株導入植物細胞植物細胞將目的基因插入染色體DNA中目的基因Ti質粒T-DNA含重組Ti質粒的農桿菌轉入農桿菌C.過程農桿菌轉化法示意圖Ti質粒目的基因構建基因表達載體轉入農桿菌導入植物細胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細胞染色體DNA中表達新性狀2.轉化的受體細胞（1）將目的基因導入植物細胞①農桿菌轉化法三.將目的基因導入受體細胞D.轉化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片__________________，然后________________，并_____________；受體細胞為_______與農桿菌共培養篩選轉化細胞再生成植株體細胞b.可以將_______直接浸沒在___________________中一段時間，然后培養植株并獲得____，再進行_____、_____等；受體細胞為_______花序含有農桿菌的溶液種子篩選鑒定受精卵2.轉化的受體細胞（1）將目的基因導入植物細胞①農桿菌轉化法三.將目的基因導入受體細胞例1.該過程經過____次拼接、____次導入？(1)第一次拼接___________________________(2)第二次拼接______________________________________________________(3)第一次導入___________________________(4)第二次導入___________________________將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌含目的基因的T-DNA導入受體細胞（非人工操作）Ti質粒目的基因構建基因表達載體轉入農桿菌導入植物細胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細胞染色體DNA中表達新性狀三.將目的基因導入受體細胞例1.該過程經過____次拼接、____次導入？(5)用農桿菌感染時，優先選擇

（受傷的/完好的）葉片與重組質粒的農桿菌培養，選用該葉片的理由是

。受傷的葉片傷口處的細胞可釋放大量的酚類物質，可吸引農桿菌(6)若要利用農桿菌轉化法轉化單子葉植物細胞，可采取添加

，其目的是

。(7)利用Ti質粒構建重組質粒的目的是：

。酚類物質吸引農桿菌移向受體細胞，有利于目的基因成功轉化將目的基因插入到Ti質粒上的T-DNA上，利用其將目的基因導入受體細胞并整合到受體細胞染色體DNA上，使目的基因的遺傳特性穩定維持和表達兩兩三.將目的基因導入受體細胞B.在植物授粉后一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進入胚囊。如A.用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②花粉管通道法我國科學家獨創的將Bt基因導入棉花細胞的方法2.轉化的受體細胞（1）將目的基因導入植物細胞C.實例:將Bt基因導入棉花細胞三.將目的基因導入受體細胞①方法：顯微注射法②操作程序：取受精卵顯微注射移植到同期發情的母畜子宮內為什么常選用受精卵作為受體細胞呢？提純基因表達載體2.轉化的受體細胞（2）將目的基因導入動物細胞三.將目的基因導入受體細胞③拓展：【其他方法】科學家也用病毒DNA

與目的基因一起構建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因導入動物細胞內。如慢病毒載體、腺病毒載體等。2.轉化的受體細胞（2）將目的基因導入動物細胞三.將目的基因導入受體細胞腺病毒載體新冠疫苗的制備將編碼新冠病毒刺突蛋白（S）基因插入腺病毒基因組中，接種后，隨載體增殖，大量所需的抗原得以表達。接種疫苗，責無旁貸！2.轉化的受體細胞（2）將目的基因導入動物細胞三.將目的基因導入受體細胞①受體細胞：微生物（常用大腸桿菌）優點：繁殖周期短體積小易于培養操作多為單細胞遺傳物質相對較少②方法流程：大腸桿菌CaCl2感受態細胞溶于緩沖液中的重組DNA分子轉化2.轉化的受體細胞（3）將目的基因導入微生物細胞三.將目的基因導入受體細胞③實例：利用轉基因大腸桿菌生產藥物原核生物作為受體細胞產生的真核生物的蛋白質通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。2.轉化的受體細胞（3）將目的基因導入微生物細胞三.將目的基因導入受體細胞種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法；花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞DNA中→表達目的基因表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態細胞→表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子【小結】三.將目的基因導入受體細胞檢查目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性；2.檢測內容及方法:類型檢測內容方法分子水平的檢測個體生物學水平的鑒定受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉錄出了mRNAPCR等技術目的基因是否翻譯成蛋白質抗原-抗體雜交技術個體是否具有相應性狀病原體接種實驗等四.目的基因的檢查與鑒定1.目的:DNA分子雜交法：

其基本原理是具有一定同源性的兩條DNA單鏈，在一定條件下（適宜的溫度等）可以按照堿基互補配對原則形成雙鏈。雜交過程中，雜交的雙方是待測的DNA和用放射性同位素標記的已知DNA片段（又稱為基因探針）。若待測DNA中有能與探針互補的四.目的基因的檢查與鑒定特異性DNA片段，用于示蹤的放射性同位素標記會指示出其所在的位置，表明目的基因已插入轉基因生物染色體的DNA中（如圖)。探究?實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定1.實驗原理（1）利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理①PCR利用了DNA的_________原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠________________的儀器，一次PCR一般要經歷___次循環；熱變性調節溫度自動調控溫度30②PCR擴增DNA片段還利用了_________________的原理；DNA半保留復制基因工程的基本操作程序（2）DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在_____的作用下，這些________會向著__________________的電極移動，這個過程就是_____；可解離的基團pH電場帶電分子電泳與它所帶電荷相反②PCR的產物一般通過_______________來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、________________和_____等有關④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為________的______下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構象基因工程的基本操作程序2.材料用具①PCR儀（自動控溫，實現DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）基因工程的基本操作程序10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等基因工程的基本操作程序

使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。3.方法步驟（1）DNA片段的擴增①移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分②離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）③反應：參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環程序變性復性延伸預變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min預變性：基因工程的基本操作程序（2）DNA片段的電泳鑒定①配制瓊脂糖溶液

根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻②制備凝膠A.將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。C.將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜B.待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。基因工程的基本操作程序3.方法步驟③加樣

將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物④電泳

接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳⑤觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相（2）DNA片段的電泳鑒定基因工程的基本操作程序3.方法步驟注意:①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。

②該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。

③在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。

⑤在進行操作時，一定要戴好一次性手套。

⑥PCR擴增不能隨意加大試劑用量。基因工程的基本操作程序3.方法步驟4.結果分析與評價(1)你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？(2)你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。進行電泳鑒定的結果應該是一條條帶，該片段大小約為750bp。

如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當等。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。基因工程的基本操作程序3.個體生物學水平的鑒定具體方法舉例轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正常四.目的基因的檢查與鑒定1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？

科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監測，2011年的數據顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數據表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續抗性篩選，已經培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。

到社會中去2.科研工作者在沒有發現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉入了一種Bt基因，抗性比較單一；現在經常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時轉入棉花細胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產生和發展，還可以通過不同基因間的互補作用擴大抗蟲范圍。

到社會中去（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉基因棉花，或在轉基因棉田周圍種植20%～30%面積的可使用化學殺蟲劑的非轉基因棉花；在印度，一些地區要求，在轉基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉基因棉花。我國除新疆棉區及大型農場需設計專門的庇護所外，其他棉區如長江、黃河流域棉區多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作)，這些作物可以構成天然的庇護所，一般無須種植非轉基因棉花作為庇護所。

到社會中去

這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個正常的取食環境，始終保持一定的敏感目標害蟲種群。這樣，即使目標害蟲對轉基因抗蟲棉產生了抗性，但是因為其與敏感目標害蟲交配，后代抗性基因會發生分離，所以抗性目標害蟲的種群也不至于迅速增加。（3）國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區種植管理、加強抗性監測、進行嚴格的安全生評價等。

到社會中去一.概念檢測1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農桿菌的Ti質粒上，然后用它侵染番茄細胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關表述是否正確。（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（

）（2）構建含有afp基因的Ti質粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。（

）（3）只要檢測出番茄細胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功。（

）√××練習與應用（P83）一.概念檢測2.利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關PCR的敘述錯誤的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶C.復性過程中引物與模板鏈的結合遵循堿基互補配對原則D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸D練習與應用（P83）二、拓展應用1.研究人員在研究轉基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩定性時，發現44株轉基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德爾遺傳規律，在它們的自交后代中出現了較多的沒有卡那霉素抗性的植株。請查找相關資料，嘗試對這個問題作出解釋。外源基因插入基因組中可能為單位點插入，或者同一染色體多位點插入，或者不同染色體多位點插入。大多數情況下，插入的位點難以做到定點插入；插入的拷貝數也是隨機的。因此，外源基因在轉基因植物中的遺傳是很復雜的。例如，科研人員在對轉GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的煙草進行基因表達分析時，發現部分轉基因植株的染色體DNA中整合了多個拷貝的基因，從而導致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩定性。練習與應用（P64）二、拓展應用2.八氫