人感染H7N9禽流感

采樣以及實驗室檢測技術湖南省疾病預防控制中心微生物檢驗科黃一偉第一頁，共26頁。流感病毒流行性感冒病毒〔簡稱流感病毒〕：是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，在分類學上，流感病毒屬于正黏液病毒科理化特性：對熱敏感,56℃30min可滅活；最適pH為～，＜和＞感染力很快被破壞；對紫外線敏感；對乙醚、氯仿、丙酮等有機溶劑均敏感。禽流感病毒滅活應該是65°30min，或者煮沸100°2min。第二頁，共26頁。GaoRB,etal,NEJM,MorensDMetal,NEJM,Dliuetal.,Lancet,YiGuanetal,Nature,第三頁，共26頁。采樣人員負責人感染H7N9禽流感病毒檢測樣本采集的操作人員必須經過生物平安培訓合格，并具備相應的操作技能。樣本采集過程中操作者要加強防護，應穿戴防護服、眼罩、N95及以上程度的醫用防護口罩、帽子、雙層醫用乳膠手套、鞋套等個體防護裝備。第四頁，共26頁。標本采集對象不明原因肺炎病例。同時具備以下4條的病例:1.發熱(腋下體溫≥38℃)；2.具有肺炎的影像學特征；3.發病早期白細胞總數降低或正常,或淋巴細胞分類計數減少；4.不能從臨床或實驗室角度診斷為常見病原所致的肺炎。人感染H7N9禽流感疑似病例 第五頁，共26頁?！羯虾粑罉吮尽舶ㄑ适米?、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液〕；◆下呼吸道標本〔如氣管汲取物、肺洗液、肺組織標本〕；◆血清標本；◆如病人死亡，應當盡可能說服家屬同意尸檢，及時進展尸體解剖，采集組織〔如肺組織、氣管、支氣管組織〕標本；注：應當盡量采集病例發病早期的呼吸道標本〔尤其是下呼吸道標本〕和發病7天內急性期血清以及間隔2-4周的恢復期血清。要求呼吸道標本：發病早期采樣，每份不少于3ml血清標本每份分為2管，每管不少于樣本類型第六頁，共26頁。咽拭子：左手用壓舌板壓住患者舌頭，右手用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時檫拭雙側咽扁桃體及咽后壁，應防止接觸舌頭，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。樣本采集方法(1)第七頁，共26頁。樣本采集方法(2)鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內鼻腭處〔通常5cm以上〕，停留片刻后緩慢轉動退出；取另1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側鼻孔；將上述2根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。患兒俯臥抬頭，采集者左手托住患兒的下頜部，右手持無菌拭子，將干拭子與上顎平行插入鼻孔〔不要向上〕直接與鼻咽后壁接觸，深度與到耳導管根本一致，輕輕旋轉5秒吸附分泌物，漸漸移出拭子，將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。第八頁，共26頁。樣本采集方法(3)拭子的要求：標本應使用頭部為合成纖維的拭子〔例如，聚酯纖維〕鋁或塑料做柄，不推薦棉拭子和木柄標本采集管應包含3毫升病毒采樣液〔含有蛋白質穩定劑，阻止細菌和真菌生長的抗生素，緩沖液〕采樣液中不能參加血清作為蛋白保護劑，可以參加BSA作為蛋白保護劑，參加BSA的采樣液應-20℃保存備用。也可參加凝膠〔gelatin〕作為蛋白保護劑。使用商品化的無菌采樣液，在別離病毒時需補加抗生素。第九頁，共26頁。樣本采集方法(4)鼻洗液患者取坐姿，頭微后仰，用移液管將5ml生理鹽水注入一側鼻孔，囑患者同時發K音以關閉咽腔。然后讓患者低頭使生理鹽水流出，用平皿或燒杯搜集洗液。重復此過程洗兩側鼻孔漱口液用10ml生理鹽水漱喉。漱時讓患者頭部微后仰，發“噢〞聲，讓生理鹽水在咽部轉動。然后，用50ml的無菌螺口塑料管搜集洗液。血清標本用真空負壓采血管采集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，搜集血清于2ml無菌螺口塑料管中。第十頁，共26頁。樣本采集方法(5)鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的搜集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。先將搜集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉搜集器頭部并緩慢退出；搜集抽取的粘液，并用采樣液3ml涮洗搜集器1次〔可用小孩導尿管接在50ml注射器上來代替搜集〕。呼吸道灌洗液：將搜集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管〔約30cm深處〕，注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉搜集器頭部并緩慢退出；搜集抽取的粘液，并用采樣液涮洗搜集器1次〔可用小孩導尿管接在50ml注射器上來代替搜集〕。第十一頁，共26頁。禽流感環境標本采集采集糞便時一定要采集新穎的〔一般較潮濕〕糞便，太陳舊〔枯燥〕的糞便對我們的檢測意義不大；在養殖戶家中采集糞便標本時，由于多雞鴨混養難以分辨鴨糞和雞糞，最好能找到鴨子剛排泄的新穎糞便；采樣液中最好已參加抗生素，否那么回實驗室要先參加抗生素處理；第十二頁，共26頁。樣本的運輸1、病毒培養物按照A類感染性物質進展包裝運輸，其他感染性物質按照B類感染性物質進展包裝運輸。2、病例的臨床標本采集后，縣級疾病預防控制機構和病例收治的醫療機構要親密配合，按照生物平安的相關規定進展包裝，在24小時內送到當地流感監測網絡實驗室進展檢測。第十三頁，共26頁。樣本的分裝與保存樣本的分裝：采集的呼吸道標本每份分為3管，每管不少于1ml。血清標本每份分為2管，每管不少于。并填寫湖南省不明原因肺炎病例疑似人禽流感病例標本送檢單。樣本的保存：所有呼吸道標本應保存在4℃，并盡快放置在‐70℃。假如沒有‐70℃度冰箱，標本應保存在4℃，但不超過24小時。切勿置于-20℃長期保存。血清樣本應置-20℃長期保存。注：標本運送期間應防止反復凍融。第十四頁，共26頁。病原學檢測〔1〕甲型流感病毒抗原篩查。呼吸道標本甲型流感病毒抗原快速檢測陽性。但僅可作為初篩實驗?！?〕核酸檢測。對患者呼吸道標本采用realtimePCR〔或RT-PCR〕檢測H7N9禽流感病毒核酸?！?〕病毒別離。從患者呼吸道標本中別離H7N9禽流感病毒?！?〕動態檢測雙份血清H7N9禽流感病毒特異性抗體程度呈4倍或以上升高。第十五頁，共26頁。檢測策略不明原因肺炎病例標本檢測：建議各流感監測網絡實驗室收到不明原因肺炎標本后，要在12小時內進展標本處理和核酸檢測，同時進展甲型/乙型通用引物，甲型H1N1流感，季節性H3N2流感，A〔H5〕、A(H7和N9)亞型流感病毒的檢測。假如H5或H7/N9亞型檢測陽性，在生物平安三級實驗室進展流感病毒的別離鑒定，無病毒別離條件的實驗室，將標本在24小時內送國家流感中心進展復核鑒定和病毒別離。第十六頁，共26頁。樣品采集/接收對于人禽流感，咽拭子比鼻拭子檢出率高。病毒滴度：氣管汲取物>咽拭子>鼻拭子，糞便中可能可檢出。標本送至實驗室后，立即進展處理，防止反復凍融。將原始標本分為三份，取一份進展檢測，其余保存在－70℃或－70℃以下，短時間保存在4℃，不要保存在－20℃。在生物平安二級實驗室從事相關實驗室活動時，操作者應穿戴眼罩、N95及以上程度的醫學防護口罩、防護服、帽子、雙層乳膠手套、鞋套等個體防護裝備；實驗活動應當有２名以上的工作人員共同進展。第十七頁，共26頁。核酸檢測流程1、樣品采集/接收2、核酸提取3、反響體系配制4、熒光PCR擴增5、結果判斷第十八頁，共26頁。結果判斷1.探針/引物的陰性對照反響中得到的熒光增長曲線不應該超過閾值線，應無CT值或為CT值為零。假如一個或者多個引物和探針的陰性反響出現了假陽性，那么樣品可能已經被污染。那么整個實驗過程是無效的，嚴格的按照步驟規那么重新實驗。2.在40個循環之前，陽性對照反響應出現陽性結果，且CT值在20–30之間。假如沒產生預期的陽性結果那么視為無效，應嚴格遵照操作程序進展重復實驗。確定PTC反響失敗原因，訂正并記錄錯誤原因及更改方案。不再使用沒產生預期結果的PTC試劑。3.當所有對照成立，檢測標本在35個循環內出現熒光信號，那么相應引物和探針陽性；假設CT值在35–40間，應重復確認，如CT值還在40內可判斷為陽性；CT值超過40，視該樣本為陰性(A型引物探針以35為閾值，其他分亞型引物探針以38為閾值)。第十九頁，共26頁。結果判斷4.所有的臨床標本RNA檢測都必須為陽性，且CT值在35.0以內才足可以證明樣品的質量是可承受的。假如臨床標本RNA檢測為陰性，那么可能是以下原因：4.1臨床樣本核酸提取不正確導致RNA的喪失或臨床標本里存在大量的RT-PCR反響抑制劑。4.2樣品中人細胞成分太少，以致于不能檢測到。4.3反響液配制錯誤或程序設置錯誤。第二十頁，共26頁。實驗操作本卷須知－防止污染應特別注意假陽性產生。推薦以下預防污染的方法：(a)實驗準備與核酸提取使用獨立區域；(b)實驗準備與核酸提取使用專用設備〔如移液器，微量離心機〕和耗材〔如微量離心管，吸頭〕；(c)實驗開場后穿清潔工作服，并使用新的一次性無粉手套；(d)不同樣本操作之間，以及疑心可能污染的情況下均更換手套；(e)試劑和反響管的蓋子應盡量關閉。第二十一頁，共26頁。陽性標本送檢要求假設當地流感監測網絡實驗室檢測結果為H7亞型禽流感病毒核酸陽性時，應當于48小時內將其中2管呼吸道相關原始標本送省級疾控中心網絡實驗室。省級疾控中心網絡實驗室在接到醫療機構和本省網絡實驗室送檢的H7和H5亞型陽性的呼吸道標本時，未能開展病毒別離的省級疾控中心網絡實驗室將陽性病例的原始標本48小時內送國家流感中心開展病毒別離。各醫療機構采集的雙份血清標本48小時內送當地流感監測網絡實驗室，由當地網絡實驗室48小時內將血清標本分別送省級疾控中心和國家流感中心開展相關抗體檢測，進展病例診斷。對于甲型通用引物陽性而不能區分型別或亞型的毒株和陽性標本要求在48小時內送至國家流感中心。第二十二頁，共26頁。環境標本檢測送檢要求對人感染H7N9禽流感確診病例可能暴露的禽類飼養或交易等場所，采集禽類糞便、籠具涂拭標本和環境污水等標本2周內開展甲型流感通用引物、H5、H7和H9亞型檢測。沒有條件開展病毒別離的實驗室在2周內將陽性標本送國家流感中心。詳細技術要求可參考?職業暴露人群血清學和環境高致病性禽流感監測方案〔年版〕?。第二十三頁，共26頁。H7N9禽流感病毒實驗室檢測策略流程圖

甲通陽性H7/H5陰性2周內完成血清標本及醫療機構檢測H7陽性標本血清標本省級CDC實驗室國家流感中心2周內完成檢測48h內具備條件開展病毒分離毒株陽性未能開展病毒分離48h內毒株和標本醫療機構疑似病例雙份血清樣本呼吸道標本無條件開展檢測或甲型抗原檢測陽性24h內

核酸檢測H7陽性，48h內送當地CDC網絡實驗室，進一步送省CDC甲型快速抗原檢測陽性的標本醫療機構未進行過檢測的疑似病例標本強化監測采集的ILI和SARI病例標本H5，H7H5/H7陽性陰性檢測結束停止甲、乙型