同學(xué)們上午好主講葉輝單位溫州醫(yī)學(xué)院生化教研室上節(jié)課的重點內(nèi)容1.掌握真核基因表達調(diào)控的特點；2.掌握順式作用元件、反式作用因子的概念及組成和轉(zhuǎn)錄因子的分類.復(fù)習(xí)與鞏固

是指利用重組DNA技術(shù)將目的基因和載體重組，再導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進行擴增和表達的過程。一.基因工程(geneticengineering)第一節(jié)基因工程基因工程相當(dāng)于目的基因的無性繁殖過程，也稱其為基因克隆(geneclone)或分子克隆（molecularclone）。

第14章基因工程及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNAT4DNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移、制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化（連），或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除5‘末端磷酸基，防止載體自身連接。二、基因工程操作中常用的工具

（一）工具酶

限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

定義:是一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基序列的核酸水解酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ

Ⅱ型限制酶識別序列特點—回文結(jié)構(gòu)

GGATCCCCTAGG

一般識別雙鏈DNA的4～8個核苷酸順序，其中以6個核苷酸順序最為常見。EcoRⅠGTTCAAGCTTAAAATTCG+GAATTCCTTAAGHpaⅡGTTAACCAATTGAACTTG+平端切口粘端切口（5’和3‘突出端）切口：黏性切口和平端切口（二）載體1.定義：是攜帶目的DNA片段進入受體細(xì)胞進行擴增和表達的工具。2.分類：(1)克隆載體(cloningvector):使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。(2)表達載體(expressionvector):使插入的外源DNA序列轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。質(zhì)粒

(plasmid)特點存在于細(xì)菌等細(xì)胞質(zhì)中雙鏈環(huán)狀DNA分子大約1-200Kb具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力不能獨立存活

在子細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)并表達其遺傳信息常用載體：細(xì)菌質(zhì)粒噬菌體黏粒病毒特點：多克隆位點篩選標(biāo)記三、基因工程的操作過程基本過程目的基因的獲取重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)菌目的基因與載體的連接克隆(或表達)載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選與鑒定克隆基因的表達

和表達產(chǎn)物純化以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程目錄（一）目的基因的獲得1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄基因組DNA文庫cDNA文庫粘性末端連接

（二）目的基因與載體的連接BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端導(dǎo)入種類載體宿主轉(zhuǎn)化質(zhì)粒細(xì)菌轉(zhuǎn)染噬菌體或病毒真核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體細(xì)菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別（三）重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體目的基因自連載體自連（四）基因工程菌的篩選直接選擇法：

抗藥性標(biāo)記選擇藍白斑篩選法

菌落或噬菌體的原位雜交非直接選擇法：免疫學(xué)方法(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇目錄重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為

小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交（五）外源基因的表達種類功能所含特異序列克隆載體外源基因擴增復(fù)制子多克隆位點篩選標(biāo)志表達載體外源基因表達復(fù)制子多克隆位點篩選標(biāo)志基因表達的調(diào)控序列克隆載體和表達載體的比較

分子雜交以DNA的變性和復(fù)性為理論基礎(chǔ)。DNA變性：DNA在某些理化因素的作用下堿基對間氫鍵破壞，由雙鏈變成單鏈的過程。DNA的復(fù)性：變性DNA的單鏈重新合成雙鏈的過程。分子雜交：不同來源的單鏈核酸通過堿基互補形成雜合雙鏈的過程。分子雜交

第二節(jié)常見分子生物學(xué)技術(shù)

一、分子雜交（molecularhybridization）

復(fù)性RNADNA（一）核酸探針（probe）

1、定義：

是分子雜交的技術(shù)基礎(chǔ)，它是一段與被檢測核酸序列互補的帶有標(biāo)記的核苷酸片段，長度一般為十幾到幾千個堿基不等。

2、探針標(biāo)記方法：（1）放射性同位素標(biāo)記（2）光敏生物素標(biāo)記（3）地高辛標(biāo)志物（4）分子信標(biāo)（二）分子雜交的方法斑點雜交(dotblothybridization)

DNA點陣（DNAarray）

基因芯片

（genechips）

原位雜交(insituhybridization)

轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)變性DNA或RNA探針雜交液NC硅片（三）印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用1、DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。2、RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。3、蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。

分子雜交實驗①②③

二、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C95?C55?C72?CPCR的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因的體外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）測定基因的表達水平三、DNA的序列分析放射自顯影凝膠電泳堿性專一性裂解反應(yīng)A/GGC/TC5’GTCGTAA5’GTCGTA5’GTCGT5’GTCG5’GTC5’GT5’G--+硫酸二甲酯——G甲酸——A/G肼——C/T肼（NaCl）——C（一）化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)（二）DNA鏈末端合成終止法四、轉(zhuǎn)基因動物、克隆動物和基因剔除技術(shù)

（一）轉(zhuǎn)基因動物定義

是利用基因工程和胚胎工程技術(shù)，改變動物遺傳性狀的新方法，是將外源基因?qū)雱游锸芫眩賹⑹芫阎踩氲酱袆游锏妮斅压芑蜃訉m中培育的動物。目錄（二）克隆動物

核轉(zhuǎn)移技術(shù)

將動物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。多利誕生過程

（三）基因剔除技術(shù)也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。又稱基因敲除（geneknockout）。基因敲入（geneknockin）定義：是指利用分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法通過直接檢測基因結(jié)構(gòu)是否改變、基因表達有否異常，對疾病作出診斷。基因診斷的概念和特點特點：

針對性強；靈敏度高；適用范圍廣；早期診斷第三節(jié)基因工程在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

（一）基因診斷（genediagnosis）

甲型血友病基因組的限制性酶切分析×BclⅠ酶切位點5′5′3′突變基因99bp142bp43bp正常基因

基因治療的概念早期將通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)用正常基因原位置換有缺陷的基因治療單