第一節(jié)

培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)

culturalcytology

指細(xì)胞在體外培養(yǎng)的特定條件下，通過對離體細(xì)胞的研究，獲取的研究結(jié)果與細(xì)胞生物學(xué)具有三個學(xué)科相似的信息。培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)何謂是培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)？

細(xì)胞生理學(xué)：

研究細(xì)胞生命活動規(guī)律，如何從環(huán)境中攝取營養(yǎng)，經(jīng)過代謝獲得能量，以促進(jìn)生長、分裂及其表達(dá)功能的。分子細(xì)胞學(xué)：

從遺傳信息(DNA—RNA—蛋白)角度研究胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和表達(dá)的調(diào)控。細(xì)胞社會學(xué)：

研究整體和細(xì)胞群中細(xì)胞間的社會行為，包括識別、胞通訊和相互作用，研究整體和細(xì)胞群對細(xì)胞生長、分化和死亡等活動的調(diào)節(jié)控制。培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方向是:揭開生、老、病、死的規(guī)律，探索優(yōu)生、抗衰老、防治疾病的手段或途徑，人為地誘導(dǎo)細(xì)胞遺傳性狀的改變，使其向更有利于人類和自然界的方向發(fā)展。培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)方向細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的相互滲透，分子克隆技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合:闡明基因的結(jié)構(gòu)與功能、闡明基因在細(xì)胞生長和分化中的作用、闡明細(xì)胞癌變機(jī)制.

活細(xì)胞的研究：是當(dāng)前生命科學(xué)研究中的重要核心問題之一。（一）病毒學(xué)（二）細(xì)胞生物學(xué)（三）細(xì)胞工程學(xué)（四）干細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

（五）淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（六）遺傳性疾病的產(chǎn)前檢查（七）毒性實(shí)驗(yàn)及生物實(shí)驗(yàn)的工具（八）在現(xiàn)代生物技術(shù)中應(yīng)用

培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

（一）病毒學(xué)培養(yǎng)細(xì)胞為病毒的增殖提供了場所。細(xì)胞是分離病毒最好和最方便的基質(zhì)，體外培養(yǎng)的細(xì)胞存在以下特點(diǎn)：無抗體；不受到非特異拮抗物質(zhì)的影響；對病毒的敏感性比體內(nèi)細(xì)胞為高。培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

利用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行病毒定性和定量，測定50％組織培養(yǎng)感染量(50％tissuecultureinfectiousdose，F(xiàn)CID5o)；用于病毒感染及防治方面的研究：在制備減毒活疫苗和診斷用抗原時(shí)，細(xì)胞是病毒增殖的場所。科學(xué)家指出：細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是伴隨著病毒學(xué)的發(fā)展而發(fā)展起來的。采用離心感染法或提取病毒核酸進(jìn)行感染，細(xì)胞打孔器協(xié)助感染可擴(kuò)大病毒感染的宿主范圍；病毒感染指標(biāo)易觀察，光鏡下可見細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect，cPE)、包涵體、細(xì)胞融合、血細(xì)胞吸附等現(xiàn)象，同時(shí)也便于用分子病毒學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測。（二）細(xì)胞生物學(xué)

單個細(xì)胞克隆便于對細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)理論進(jìn)行研究，如形態(tài)、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器及其功能、遺傳物質(zhì)、核型、變異、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生長周期等。培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

離體培養(yǎng)細(xì)胞便于進(jìn)行環(huán)境因素、藥物等單因素及多因素影響的研究，探索作用機(jī)制。當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，通訊和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖與細(xì)胞周期的調(diào)控、生長和分化、衰老和死亡以及干細(xì)胞的應(yīng)用研究和細(xì)胞工程是以培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)為基礎(chǔ)，以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為手段和工具。（三）細(xì)胞工程學(xué)利用細(xì)胞融合及雜交技術(shù)，進(jìn)行細(xì)胞工程的研究與開發(fā)。如生物反應(yīng)器的開發(fā)研究，將編碼某生物活性物質(zhì)的基因?qū)雱游锸芫眩瑥倪@種受精卵發(fā)育的動物組織、體液分泌物中獲得外源基因的表達(dá)產(chǎn)物。培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

（四）干細(xì)胞的培養(yǎng)機(jī)體最原始細(xì)胞，具有較強(qiáng)的再生能力，在一定條件下可分化、增殖出各類細(xì)胞。干細(xì)胞的數(shù)量極少，故需分離、保存并在體外大量培養(yǎng)，長成各種組織和器官。主要集中在造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞上，已成為干細(xì)胞研究的首要課題。培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

(五）淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用在培養(yǎng)環(huán)境中，淋巴細(xì)胞受某些生長因子的刺激，出現(xiàn)旺盛的分裂、增殖。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的成功對反映機(jī)體免疫功能狀況起很大作用，如研究細(xì)胞標(biāo)記，檢測T、B細(xì)胞數(shù)量及功能，檢測T細(xì)胞亞群(CD3、CD8、CD4．等細(xì)胞)的變化。培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

（六）遺傳性疾病的產(chǎn)前檢查

羊膜穿刺術(shù)獲得羊水中的胎兒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在妊娠早期診斷胎兒是否患有先天性遺傳病。少量胎兒脫落細(xì)胞是能分裂的，經(jīng)2—4周生長，形成顯著單層上皮樣細(xì)胞，可按常規(guī)制備染色體。

培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

檢測甲胎蛋白(alpha—fetoprotein，AFP)等，產(chǎn)前檢測出幾十種代謝病與遺傳病，較準(zhǔn)確地指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。（七）毒性實(shí)驗(yàn)及生物實(shí)驗(yàn)的工具

培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)對化學(xué)物質(zhì)、放射線、激素、藥物等提供了最簡易而又可靠的方法，并對毒性機(jī)制研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)對象。對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥物的藥敏測試，以指導(dǎo)臨床抗癌藥物的使用及配伍。培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

（八）在現(xiàn)代生物技術(shù)中應(yīng)用基因分離、基因測序與表達(dá)、基因轉(zhuǎn)移與重組、癌基因研究等。首只轉(zhuǎn)基因猴“安迪”安迪于２０００年１０月２日出生于俄勒崗醫(yī)學(xué)大學(xué)。

培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

第二節(jié)

體外培養(yǎng)

vitrocultural組織培養(yǎng)tissueculture細(xì)胞培養(yǎng)cellculture器官培養(yǎng)organculture培養(yǎng)細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

一、培養(yǎng)分類

組織培養(yǎng)

從體內(nèi)取出組織模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。組織培養(yǎng)

常用上皮組織:胚胎發(fā)育的內(nèi)、中、外三個胚層均可分化成上皮組織。細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞間常以黏著物和特殊連接牢固相連。身體不同部位的上皮組織，所處的位置有著不同的功能，主要表現(xiàn)為保護(hù)、吸收、排泄和分泌等功能。分為被覆上皮、腺上皮、感覺上皮、生殖上皮和肌上皮等。上皮細(xì)胞濃度：（1～3）x105/ml成纖維細(xì)胞濃度：（2～6）x105/ml

接種

培養(yǎng)物是單個細(xì)胞或細(xì)胞群。細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)都要生活在人工環(huán)境中，由于環(huán)境的改變，細(xì)胞的移動或受一些其他因素的影響，培養(yǎng)時(shí)間加長，傳代導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)單一化型。細(xì)胞培養(yǎng)器官培養(yǎng)：與組織培養(yǎng)條件相似，培養(yǎng)的是器官的原基，器官的一部分或整個器官，以便能夠在體外生存、生長和保持一定功能的方法。器官培養(yǎng)

根據(jù)是否附于支持物上生長的特性分為:

貼附型和懸浮型（一）貼附型

細(xì)胞貼附在支持物表面生長，只依賴貼附才能生長的細(xì)胞叫做貼附型細(xì)胞(Anchorrage-dependentcells)這種現(xiàn)象與細(xì)胞分化有關(guān)。二、細(xì)胞的特性

貼附型細(xì)胞的分型

1.成纖維型細(xì)胞：(fibroblast)來自中胚層特點(diǎn)：與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)相似,胞體梭型或不規(guī)則三角形,中央有圓形核,胞質(zhì)向外伸出2～3個長短不同的突起。細(xì)胞在生長時(shí)呈放射狀,漩渦或火焰狀走行。

貼附型細(xì)胞的分型

起源：細(xì)胞來自中胚層間充質(zhì)組織。除真正的成纖維細(xì)胞、心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞。注意：細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)成為成纖維型細(xì)胞是一種慣稱,與體內(nèi)細(xì)胞不同。

2.上皮型細(xì)胞(epithliumcelltype)

來自外胚層

特點(diǎn)：扁平不規(guī)則多角型、圓形核、細(xì)胞緊密相連成細(xì)胞增殖數(shù)目增多時(shí),整個上皮膜隨之移動。邊緣細(xì)胞很少脫離細(xì)胞群而單獨(dú)活動“

拉網(wǎng)”現(xiàn)象與起源內(nèi)外胚層組織有關(guān)。

2.上皮型細(xì)胞(epithliumcelltype)

組織:皮膚表皮及其衍生物(汗腺、皮脂腺)消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。

3.游走型細(xì)胞(wanderingcelltype)特點(diǎn)：在支持物上散在生長,不連接成片,胞質(zhì)伸出偽足或突起呈活躍的游走或變形運(yùn)動,速度快不規(guī)則,密度大連接成片呈多角形不易與其他類型的細(xì)胞區(qū)別。

4.多形型細(xì)胞(polymorphiccelltype)

特點(diǎn)：無規(guī)律的形態(tài)，如神經(jīng)細(xì)胞。

（二）懸浮型細(xì)胞(suspendedcelltype)特點(diǎn)：不貼附在支持物生長，胞體圓形，在培養(yǎng)液中生長空間大，可長時(shí)間的生長，繁殖旺盛便于做細(xì)胞代謝研究。S180肉瘤、K562、HL－60和白細(xì)胞。

分型的目的：方便描述細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化。培養(yǎng)條件好時(shí)，細(xì)胞相對穩(wěn)定，可反映出起源、正常異常的區(qū)別，作為判定細(xì)胞生物學(xué)性狀指標(biāo)。但一般形態(tài)并不是一項(xiàng)可靠指標(biāo)要受各方面影響。如：反復(fù)開關(guān)溫箱、溫度、C02的濃度、培養(yǎng)基變堿、支原體、pH值。細(xì)胞在接種時(shí)呈三角型狀態(tài)，經(jīng)培養(yǎng)一定時(shí)間后，細(xì)胞在傳代前已形成上皮型細(xì)胞。

三.細(xì)胞生長與增殖

培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、器皿或其他容器，生存空間及營養(yǎng)有限，當(dāng)細(xì)胞增殖到一定密度后，分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，使細(xì)胞更好地生存，這一過程稱之為“傳代”(passage或subculture)。值得注意的是：每次傳代細(xì)胞在生長和增殖方面受到一定的影響。

三.細(xì)胞生長與增殖

（一）細(xì)胞生命期(lifespanofculturecells)指細(xì)胞在培養(yǎng)過程中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。一般根據(jù)細(xì)胞種類、性狀和原供體的年齡的情況而定。

例如：二倍體成纖維細(xì)胞，在不凍存和反復(fù)傳代條件下可傳30～50代，相當(dāng)于150～300個細(xì)胞增殖周期，能維持一年左右的生命，細(xì)胞便開始凋亡(apoptosis)。細(xì)胞在生存過程中經(jīng)歷以下三個階段

老化死亡接種培養(yǎng)第一次傳代傳代期初代培養(yǎng)細(xì)胞系連續(xù)細(xì)胞系轉(zhuǎn)化0246810121416周指數(shù)細(xì)胞數(shù)量正常培養(yǎng)細(xì)胞生命期1.原代培養(yǎng)期(primaryculture)組織到第一次傳代時(shí)間大約為1～4周特點(diǎn)：細(xì)胞活躍移動,分裂,但不旺盛多呈二倍體核型。原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動基本相似。

各細(xì)胞的遺傳性狀互不相關(guān)，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)，如果把這種稀釋分散成單細(xì)胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞克隆的形成率(cloningefficiency)下降，表明細(xì)胞獨(dú)立生存性差。

2.傳代期(passage)初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代便稱之為細(xì)胞系(cellline)特點(diǎn)：細(xì)胞增殖旺盛，并維持二倍體核型，也叫二倍體細(xì)胞系(diploidcellline)為了保存二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代或傳代早期凍存為好。

一般細(xì)胞在10代以內(nèi)凍存。

凍存配方：向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。存于在液氮中溫度可達(dá)到－196℃，可長期儲存。如解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)增殖生長，細(xì)胞性狀不受影響，成為保存細(xì)胞最主要的手段。

3.衰退期特點(diǎn)：細(xì)胞仍生存增殖減慢不增殖輪廓增強(qiáng)衰退凋亡注意：細(xì)胞在三期中的任何一期（一般發(fā)生在傳代后期或衰退期）在某些因素影響下,如血清質(zhì)量不佳、病毒污染、溫度和pH不穩(wěn)等,細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(spontaneoustransformation);

細(xì)胞可能獲得永生性(immortality)或稱為惡性(malignancy)。細(xì)胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細(xì)胞群體稱為連續(xù)細(xì)胞系(continuouscellline)。當(dāng)細(xì)胞獲得不死性后,細(xì)胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。

（二）培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期

“一代”指細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的所用的時(shí)間。與細(xì)胞倍增一代不是一個含義。在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次，經(jīng)歷三個階段：指數(shù)增生期細(xì)胞數(shù)增大極限點(diǎn)細(xì)胞增殖率極限點(diǎn)潛伏期平頂期衰退死亡細(xì)胞增生數(shù)

024487296120時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞一代增殖生長過程貼附現(xiàn)象是復(fù)雜和受多種因素的影響。細(xì)胞不貼附：底物表面不干凈，影響細(xì)胞貼附。利于細(xì)胞貼附：底物表面帶有陽性物質(zhì)與特殊物質(zhì):纖粘連蛋白(fibronectinFN)、細(xì)胞表面蛋白(cellsurfaceproteinCSP)這些物質(zhì)有的存在與細(xì)胞表面,有的來自血清。1.潛伏期(latentphase)：接種經(jīng)過懸浮期(細(xì)胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形)貼壁。初代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過10～24小時(shí)或更多時(shí)間。連續(xù)細(xì)胞系和癌細(xì)胞系經(jīng)過10～30分鐘貼附。

潛伏期特點(diǎn)：長短與細(xì)胞接種密度、種類、使用的培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。(1)細(xì)胞貼附后進(jìn)入潛伏期,細(xì)胞無增殖。少見分裂相，細(xì)胞有運(yùn)動活動。(2)初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期約為24～96小時(shí)或更長，

連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期約6～24小時(shí)。(3)細(xì)胞接種密度大潛伏期短。(4)細(xì)胞出現(xiàn)分裂相增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增生期。

2．指數(shù)增生期(logarithmicgrowthphase)：特點(diǎn)：細(xì)胞增殖最旺盛階段,分裂相增多。細(xì)胞分裂指數(shù)(mitotieindexMI)：表示每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。條件：分裂相數(shù)與細(xì)胞種類、培養(yǎng)成分、pH培養(yǎng)箱溫度有關(guān)。

細(xì)胞分裂指數(shù)：初代細(xì)胞：在0.1％～0.5％之間％,連續(xù)分裂細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞：3～5％。指數(shù)增生期是作為細(xì)胞一代活力最好的時(shí)期,是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最好和最主要的階段。指數(shù)增生期持續(xù)3～5天，細(xì)胞數(shù)量增多后生長空間變小，細(xì)胞相互接觸可連接成片。

正常細(xì)胞：細(xì)胞相互接觸能抑制細(xì)胞運(yùn)動，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制(contactinhibition)。腫瘤細(xì)胞：沒有這種現(xiàn)象，可作為區(qū)別正常與腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一。當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá)到一定密度后向三維空間發(fā)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積(piledup)。

由于細(xì)胞不斷增殖分裂，細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增多，培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多，細(xì)胞受營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制(Densityinhibition),導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。

3.停滯期(stagnatephase)細(xì)胞量和密度達(dá)到飽和，細(xì)胞停滯增殖。表明細(xì)胞進(jìn)入到停滯期,細(xì)胞數(shù)量持平，也稱為平頂期(plateau）。

特點(diǎn)：細(xì)胞不增殖,有代謝活動。培養(yǎng)液中的營養(yǎng)已逐漸耗盡,代謝產(chǎn)物積累增多,pH降低，此時(shí)需要傳代,否則細(xì)胞將會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,細(xì)胞會從底物脫落死亡。

注意：傳代過晚將影響下一代細(xì)胞的生長,至少要再傳

1～2代。通過換液淘汰死細(xì)胞和受損較輕的細(xì)胞。待細(xì)胞全部恢復(fù)后再用。在這一點(diǎn)上操作時(shí)一定要特別注意。

分散生長接觸抑制消失接觸抑制何種細(xì)胞？

細(xì)胞？G1期特點(diǎn)：細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)。細(xì)胞持續(xù)時(shí)間的長短取決與營養(yǎng)物質(zhì)的獲得和生長因子的作用短則4～6小時(shí)，長可達(dá)幾天；此期細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、RNA合成、核糖核蛋白體合成增多，胞體增大，是鏡下唯一可見的變化。

四.培養(yǎng)細(xì)胞的增殖過程

G1期的細(xì)胞是接收外界因子影響的特定階段稱為調(diào)節(jié)點(diǎn)(reguluationpointRP)如細(xì)胞獲取營養(yǎng)不足或因子的缺乏在R點(diǎn)作用下,細(xì)胞在G1期發(fā)生受阻,G1期時(shí)間延長。

S期特點(diǎn)：細(xì)胞發(fā)生DNA合成，約為6～8小時(shí)，DNA合成一經(jīng)開始，能持續(xù)進(jìn)行，獨(dú)立性較大，并對環(huán)境不利因素有一定耐受能力。由于DNA在進(jìn)行合成時(shí)，多核苷酸雙鏈發(fā)生分離，細(xì)胞易受到突變或致癌因素作用的影響。值得注意：

S期是遺傳物質(zhì)易受突變物損傷的時(shí)期。

G2期特點(diǎn)：DNA含量加倍，具有4倍量的DNA。細(xì)胞持續(xù)時(shí)間較短平均為2～5小時(shí)。細(xì)胞發(fā)生與細(xì)胞分裂有關(guān)的RNA合成和染色質(zhì)螺旋化。細(xì)胞對外界環(huán)境敏感，易受溫度、pH及各種其他因素的影響而受阻，不能進(jìn)入M期。當(dāng)不利因素消除后,細(xì)胞能很快恢復(fù)。

M期特點(diǎn)：是研究細(xì)胞有絲分裂過程理想的對象，細(xì)胞分裂相形態(tài)和分裂過程，在相差顯微鏡下可清晰觀察到。

細(xì)胞分裂過程分期：

前期：細(xì)胞質(zhì)逐漸回縮，細(xì)胞體變園與底面附著面減少，脫落入培養(yǎng)液中，染色體由分散狀態(tài)開始向細(xì)胞中央部移動，突然“凍結(jié)”于赤道平面，前期持續(xù)時(shí)間為20～30分鐘。

中期：正在發(fā)生的變化：復(fù)制后的染色體任意地排在紡錘體的中央(稱赤道板)。

后期:染色體分成兩組分別向兩極移動,整個細(xì)胞由圓球形變成橢圓形,胞體呈啞鈴形,后期時(shí)兩組染色體相互分離。細(xì)胞分裂過程最快持續(xù)時(shí)間5～7分鐘，在鏡下可直接觀察到。

末期：兩組染色體達(dá)到兩極,胞體中部變細(xì)染色體變成染色質(zhì),核仁核膜再現(xiàn)、胞體逐漸分離、形成兩個子細(xì)胞,有細(xì)絲相連,經(jīng)過較長時(shí)間兩個子細(xì)胞各自獨(dú)立。

細(xì)胞質(zhì)延展于底物變扁。末期持續(xù)時(shí)間為20～30分鐘。

細(xì)胞分裂全程持續(xù)時(shí)間一般為30～60分鐘。因細(xì)胞種類不同和溫度變動,分裂時(shí)間將有一定差別。

一定條件下：單個細(xì)胞表現(xiàn)獨(dú)立性，生存和增殖,但不能長久生存。有活力的細(xì)胞需要繁殖形成群體細(xì)胞，是培養(yǎng)細(xì)胞的基本存在形式。與體內(nèi)細(xì)胞相似,細(xì)胞與細(xì)胞之間具有形態(tài)和機(jī)能上相互依存關(guān)系。

結(jié)構(gòu):上皮細(xì)胞可見橋粒,說明細(xì)胞間有擴(kuò)散的能力。五.細(xì)胞和細(xì)胞、細(xì)胞和基質(zhì)的相互關(guān)系

生理活動四個要點(diǎn):單個細(xì)胞生存能力不如群體細(xì)胞強(qiáng),說明細(xì)胞之間能相互溝通信息。正常細(xì)胞一旦兩相鄰細(xì)胞發(fā)生接觸，出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象,導(dǎo)致運(yùn)動停止。

生理活動四個要點(diǎn):正常細(xì)胞群體依賴性（populationdependencePD）比惡性細(xì)胞PD小。單細(xì)胞培養(yǎng)和軟瓊脂培養(yǎng)是檢測細(xì)胞PD的常用方法。

體內(nèi)細(xì)胞：細(xì)胞的分化與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrixECM)有密切關(guān)系。離體培養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞對ECM也仍有依存性。應(yīng)用適應(yīng)的ECM（如上皮細(xì)胞對膠原）能誘導(dǎo)細(xì)胞特性表達(dá)；ECM對細(xì)胞貼附、分化、生長和增殖等都起到重要作用。

小結(jié)--細(xì)胞生存狀態(tài)體外培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞相同,體外細(xì)胞具有兩種生存狀態(tài):增殖態(tài):通過分裂增殖,細(xì)胞數(shù)量增加;分化態(tài):向特定方向分化,完成細(xì)胞特定功能活動,如保護(hù)、分泌、吸收和排泄等。細(xì)胞兩種功能狀態(tài)是相對的，交替發(fā)生并相互依存。

培養(yǎng)細(xì)胞生存途徑和物質(zhì)代謝與體內(nèi)細(xì)胞基本相同，隨生存環(huán)境改變出現(xiàn)一定差異。（一）環(huán)境培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證培養(yǎng)細(xì)胞生存的首要條件。保證細(xì)胞生存環(huán)境無任何污染、代謝物及時(shí)清除，是維持細(xì)胞生存的基本條件。

六.細(xì)胞生存環(huán)境、條件和代謝

(二)溫度：人哺乳動物：36.5℃±0.5℃;鳥類：38.5℃;培養(yǎng)細(xì)胞對低溫耐受力比高溫強(qiáng)；溫度上升不超過39℃時(shí),細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比。39～40℃1小時(shí),受損傷的細(xì)胞可能恢復(fù)；41～42℃1小時(shí),嚴(yán)重?fù)p傷,個別細(xì)胞恢復(fù)；43℃以上1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。溫度不低于0℃時(shí),細(xì)胞代謝有影響,無傷害作用;置于25～35℃，細(xì)胞能生存，但生長速度減慢；放在4℃數(shù)小時(shí),再放回37℃細(xì)胞仍繼續(xù)生長。細(xì)胞代謝隨溫度降低而緩慢，溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí),細(xì)胞因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡。

(三)氣體環(huán)境和氫離子濃度氣體：氧氣和二氧化碳

氧氣:參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種所需成分。開放式培養(yǎng)(碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng))細(xì)胞置于95％空氣加5％二氧化碳混合氣體環(huán)境中。

CO2:

細(xì)胞代謝產(chǎn)物,是細(xì)胞所需成分。主要作用:維持培養(yǎng)基的pH值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH7.2~7.4，偏離此范圍對細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響。有些細(xì)胞存在差異。如羊水細(xì)胞培養(yǎng)檢測染色體時(shí)pH為7.6。

細(xì)胞耐酸比耐堿性大一些,在偏酸性環(huán)境中更有利于細(xì)胞生長。為了維持培養(yǎng)液恒定的pH，最常用磷酸緩沖劑方法。磷酸緩沖劑中NaHco3,可供給CO2但容易逸出，適用：封閉式培養(yǎng)的細(xì)胞。（無CO2培養(yǎng)箱）

Hanks平衡液:

含有低濃度的NaHCO3,當(dāng)打開含有Hank液培養(yǎng)瓶時(shí)，CO2迅速逸出而導(dǎo)致酚紅指示劑變紅，表明培養(yǎng)液pH變堿，細(xì)胞在堿性的環(huán)境中時(shí)間過長可使細(xì)胞堿中毒。

羥乙基哌嗪乙硫磺酸(N`-2-HydroxyethylPiperazine-N`-EthanesulfonicAcid縮寫HEPES)HEPES：

對細(xì)胞無毒性也不起緩沖作用，主要作用是：防止pH迅速變動，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時(shí)能維持恒定的pH。（四）細(xì)胞生存所需基本物質(zhì)與體內(nèi)基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂類三大類營養(yǎng)物質(zhì)外，一定量的無機(jī)鹽、維生素和微量元素等，但需要的量以及代謝方式與體內(nèi)細(xì)胞不盡相同。糖：六碳糖是主要的能源通過糖酵解形成乳酸和通過檸檬酸形成CO2。胚胎細(xì)胞和一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基中常見到乳酸堆積現(xiàn)象。糖是合成某些氨基酸的原料；經(jīng)過乙酰輔酶A（CoA）合成脂肪；經(jīng)過糖解磷酸通路能合成核酸。各種糖的吸收取決于它們進(jìn)入細(xì)胞的能力,其中葡萄糖最強(qiáng),半乳糖最低。2.氨基酸：

12種氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、異亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的原料。

所有細(xì)胞都需要谷胺酰胺，其特殊的作用,可促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜。所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的來源；是合成3，2和一磷酸腺苷時(shí)所需物;是能源和碳的來源。如沒有谷胺酰胺細(xì)胞生長不良而發(fā)生細(xì)胞死亡。所以要求各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷胺酰胺。

谷胺酰胺在溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)放置在－20℃冰箱保存，用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含有谷胺酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱內(nèi)可放置兩周以上時(shí)重新加入原來量的谷胺酰胺。需要維生素、生物素、葉酸、胭酰胺、核黃素、硫胺素、泛酸、吡多醇及B12等。這些維生素在常用培養(yǎng)基中已成為固定組成分。脂溶性維生素對細(xì)胞生長也有作用,一般從血清中得到補(bǔ)充。3.促生長因子：培養(yǎng)液除營養(yǎng)成分外，也需要激素類物質(zhì)起到促進(jìn)細(xì)胞增殖生長作用。胰島素(1-10單位)促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸；氫化可的松(10-8-10-7M)促進(jìn)表皮上皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞增殖生長的作用，提高神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的克隆形成率；

雌激素和雄激素，或使用黃體酮和氫化可的松對乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)效果則更好。血清是提供生長因子和其細(xì)胞所需物質(zhì)的來源。目前血清、各種組織和其它生物成分用生物工程的方法提取并商品化。

4.

其它物質(zhì)：

在細(xì)胞生長過程中,需要鉀、鈉、鈣、鎂氮和磷以外，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒銅、錳、鉬釩等。需要促細(xì)胞粘附物質(zhì)其作用是：有助于促細(xì)胞貼附在各種底物或支持物上組織生長。

5.人工培養(yǎng)基：細(xì)胞在體外的生存環(huán)境是人工模擬的，除注意到無菌、溫度、空氣等條件外，最主要的是培養(yǎng)基，是供給細(xì)胞營養(yǎng)和保證細(xì)胞生長組織的物質(zhì)。培養(yǎng)基種類:半固體和液體培養(yǎng)基兩類。

液體培養(yǎng)基：分為合成、天然和無血清培養(yǎng)基三種。

A．合成培養(yǎng)基：成分清楚,通過調(diào)節(jié)各種成分的數(shù)量和種類,再借觀察細(xì)胞生物狀況反應(yīng)性變化,測定細(xì)胞與外界環(huán)境的適應(yīng)能力。借以了解細(xì)胞生存條件,誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行定向分化的等。

合成培養(yǎng)基在應(yīng)用上廣泛。B．天然培養(yǎng)基：

用人或動物血清、血漿和胎汁等。常用牛血清。血清含有多種促生長因子、貼附因子及其它活性物質(zhì)等。加入5％血清：維持細(xì)胞不死或緩慢生長；加入10％～20％血清：細(xì)胞增殖生長。血清的主要作用提供細(xì)胞生存、生長和增殖所必需的生長調(diào)節(jié)因子。補(bǔ)充培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。含有生長基質(zhì)成分使細(xì)胞易貼附在培養(yǎng)器皿上。血清的主要作用提供載體蛋白，可結(jié)合維生素、脂質(zhì)、金屬離子等。有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害。提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞不受死細(xì)胞釋放的蛋白酶的損害。血清存在的問題存在有害于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì)。如補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子。成分不明確，影響對結(jié)果的分析。不同動物、不同批次的血清和活性差別較大，使培養(yǎng)的結(jié)果不穩(wěn)定。C.無血清培養(yǎng)基(serumfreemediumSFM)：條件培養(yǎng)液其成分已知；排除含血清培養(yǎng)基的未知成分的干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。主要應(yīng)用：蛋白質(zhì)組和生物工程的研究。在無血清培養(yǎng)基中，可以加入其他來源的蛋白質(zhì)，如：白蛋白、牛腦垂體提取物、植物提取液。具有促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的作用。

6.附著底物:除少數(shù)懸浮型細(xì)胞外,絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞需附著在適宜的底物上生長。不同細(xì)胞對底物要求不同，底物不適對細(xì)胞生長不良。常用的底物：A.玻璃：如用NaOH處理，性質(zhì)能受到一定影響;酸中和以后再用（新的鹽酸泡）易碎。B.一次性塑料：聚苯乙烯:多為一次使用。聚四氟乙烯包括：

充電荷：親水性，適用單層培養(yǎng)不充電荷：疏水性，適用巨噬細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)。聚四氟乙烯透氣性好可制成薄膜，剪成小塊后放入各種瓶皿中，適于細(xì)胞貼附生長，也便于取出，可進(jìn)行染色和做電鏡切片。7.抑制細(xì)胞生長因素1.培養(yǎng)液消毒2.操作不慎使有毒物質(zhì)混在細(xì)胞生存的環(huán)境中，抑制細(xì)胞生長。3.血清滅活處理可除去補(bǔ)體和降低免疫球蛋白的毒性,并不損傷多肽生長因子，但可能消滅另一些更有用的營養(yǎng)成分，因此有人提出，滅活血清不一定比不滅活血清更好。第三節(jié)

培養(yǎng)細(xì)胞的分類

正常細(xì)胞

腫瘤細(xì)胞

正常細(xì)胞培養(yǎng)

人或動物體外培養(yǎng)都不易，建立細(xì)胞系更難。原因：是分化細(xì)胞；生存條件嚴(yán)格；目前沒有模擬與體內(nèi)完全一樣的方法；只要一切條件適當(dāng)時(shí),仍有培養(yǎng)成功的可能；初代比傳代容易。體外培養(yǎng)的上皮組織基本特點(diǎn)

來源：外、內(nèi)、中三個胚層。特征：1.細(xì)胞排列密集，易形成膜狀呈貼壁性生長。細(xì)胞常相互粘附，具有生長的接觸性抑制現(xiàn)象。2.上皮組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能同樣表現(xiàn)出極性。3.細(xì)胞的增殖和分化依賴于促細(xì)胞生長因子的作用。3.上皮細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)，如微絨毛、緊密連接、橋粒等，在培養(yǎng)細(xì)胞中也可見到。細(xì)胞極性（Cellpolarity）:A.是指細(xì)胞在形態(tài)和功能上的方向性和不對稱B.形成的中樞位于中心體。

中心體是細(xì)胞的中心。間期細(xì)胞的中心體只有一個，從中放射出微管系統(tǒng)。中心體只能位于細(xì)胞核的一側(cè)，這便有了“上下”之分。C.細(xì)胞內(nèi)許多細(xì)胞器的定位、物質(zhì)的運(yùn)輸和分揀等，均與微管運(yùn)輸?shù)南蛑龢O或向著負(fù)極方向有關(guān)。定向轉(zhuǎn)運(yùn)體系:該體系能夠確保哪些物質(zhì)被運(yùn)送到上皮細(xì)胞的質(zhì)膜頂區(qū)，哪些被運(yùn)送到細(xì)胞的側(cè)面或底面。例如，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體再到胞內(nèi)體和分泌囊泡的定向轉(zhuǎn)運(yùn)體系就是通過與微管系統(tǒng)的偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)其方向性的，

細(xì)胞表面:由細(xì)胞表面提供的方向信息也可以通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架系統(tǒng)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。細(xì)胞皮質(zhì):細(xì)胞皮質(zhì)可以選擇性地吸附不同種類的mRNA，使細(xì)胞內(nèi)形成蛋白質(zhì)合成的濃度梯度，從而提供極性參照物質(zhì)。上皮組織的細(xì)胞培養(yǎng)條件要求比較高，常需生長在特殊的生長基質(zhì)，極易失去在體內(nèi)巳有的分化特征，如細(xì)胞極性等。注意：保證上皮細(xì)胞在體外的生長和繁殖；應(yīng)盡可能地恢復(fù)和誘導(dǎo)上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)下的分化。這是上皮組織體外培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵。上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的特殊條件

(1)防范微生物污染：根據(jù)上皮組織分布的特性，位于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的上皮組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸，組織本身帶有各種病原微生物或受其污染的機(jī)會較多。要求在組織取材時(shí)就嚴(yán)格滅菌；分離、種植、培養(yǎng)等諸多操作步驟上都要設(shè)法消除可能會出現(xiàn)的微生物污染。培養(yǎng)中所使用的各種液體，包括細(xì)胞保存液、分離液以及培養(yǎng)基等需添加抗生素，抗生素濃度比其它組織培養(yǎng)高。(2)生長基質(zhì)的支持：上皮細(xì)胞依賴貼附于某種支持物上才能生長，即所謂的貼壁依賴性細(xì)胞。在培養(yǎng)器皿表面包被生長基質(zhì)，如膠原或其它細(xì)胞外基質(zhì)成分等，模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu)，不僅特別有利于上皮細(xì)胞的貼附和生長，也有利于培養(yǎng)細(xì)胞的分化．使細(xì)胞極性表現(xiàn)更為明顯。(3)特殊的培養(yǎng)基：培養(yǎng)基有M199、RPMl1640、DMEM和HamFl2。其中以M199和RPMl1640較為常用。M199和RPMI1640培養(yǎng)基僅適用于上皮組織的短期培養(yǎng)和維持其生存，對上皮組織的長期培養(yǎng)和促增殖作用并不明顯。M199和RPMl1640DMEM和HamFl2培養(yǎng)基用于上皮組織培養(yǎng)時(shí)有其特殊作用。可促進(jìn)上皮細(xì)胞的貼附；維持上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)的分化。DMEM和HamFl2特別適用原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分中添加微量元素的無機(jī)離子，更加利于細(xì)胞的生長和代謝。在實(shí)際培養(yǎng)時(shí)，將DMEM與HamFl2按一定比例混合用于上皮組織培養(yǎng)。加入血清，但出廠血清成分復(fù)雜，含有一定量的有毒物和抑制物。HamFl2培養(yǎng)基的特殊性(4)去除成纖維細(xì)胞：上皮組織借薄層基膜和結(jié)締組織相連。取材分離細(xì)胞時(shí)會帶入少量結(jié)締組織成分，常常造成成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞混和生長。由于成纖維細(xì)胞具有增殖能力和粘附能力強(qiáng)的特點(diǎn)，很容易“瘋長”為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢細(xì)胞群，從而干擾或抑制上皮細(xì)胞的生長，成為上皮細(xì)胞的“細(xì)胞污染源”。

成纖維細(xì)胞>上皮細(xì)胞

因在上皮細(xì)胞的取材、分離、種植和傳代的培養(yǎng)過程中，要特別注意上皮細(xì)胞的純化，去除和抑制成纖維細(xì)胞的生長。

內(nèi)皮細(xì)胞：來源：人臍帶臍靜脈，動物動脈消化：用膠原酶比胰蛋白酶消化好。但要注意掌握消化時(shí)間和雜細(xì)胞（成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）。內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定用免疫組化染色檢測VIII因子相關(guān)抗原和CD34抗原,鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。觀察細(xì)胞是否呈單層貼壁生長,細(xì)胞形態(tài)，如長梭形、多角形三角形、四邊形為主,呈典型的“鋪路石”樣征象；觀察第三代細(xì)胞純度是否達(dá)95%以上。如消化時(shí)間過長或操作不慎、刮取過重時(shí)，會造成血管內(nèi)皮下層與外膜成纖維細(xì)胞以及中膜平滑肌細(xì)胞污染。由于這些雜細(xì)胞生長較快，隨著傳代次數(shù)越多，其污染的程度越重，從而使培養(yǎng)失敗。介紹排除雜細(xì)胞的方法：1、使用含肝素的培養(yǎng)液：在培養(yǎng)液中加入90U／ml的肝素，可使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高；2、在相差顯微鏡下刮去明顯的雜細(xì)胞群。排除雜細(xì)胞的方法

表皮細(xì)胞:來源：小兒包皮、全皮細(xì)胞不易與成纖維細(xì)胞混合生長區(qū)分。以膠原為底物；pHCa2+

溫度低易生長；在培養(yǎng)基中加入氫化可的松(10g/ml〕；或10-6異丙腎上腺素；或10-10霍亂毒素；或10ng/ml表皮生長因子；上述任何一種物質(zhì)細(xì)胞易生長。

巨噬細(xì)胞：特點(diǎn)：保持原有形態(tài)和吞噬物功能，易于分離不易建立傳代細(xì)胞系，生存2～3周無刺激：小鼠/只2～3106個/只刺激物：牛血清、礦物油、硫羥乙酸鹽，刺激1ml/只20～30106個/只,但刺激物難消化掉，殘留在細(xì)胞內(nèi)，干擾細(xì)胞生長。用40ugPHA注射腹腔中6～18106個/只，效果好。PHA:植物凝集素乳腺細(xì)胞：來源：腺上皮細(xì)胞消化：膠原酶注意：接種底物加膠原使用1640培養(yǎng)基加10％小牛血清,補(bǔ)加氫化可的松、胰島素；乳腺細(xì)胞易生長。心肌細(xì)胞：來源：心室肌,1～3ｄ齡,

剪成0.5～1ｍｍ3大小組織塊,放入錐形瓶中。消化：加入(0.8ｇ/Ｌ)膠原酶Ⅰ,在37℃水浴,磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為100ｒ/ｍｉｎ,消化10分鐘。消化:膠原酶Ⅰ,0.25%胰蛋白酶易于生長：50ｍｇ/Ｌ多聚賴氨酸涂在培養(yǎng)瓶內(nèi).注意：分次消化可減輕膠原酶或胰蛋白酶對單細(xì)胞的破壞作用。消化溫度在35～37℃左右,過高溫度會增加膠原酶或胰蛋白酶的毒性,溫度過低會降低膠原酶或胰蛋白酶的活性。心肌細(xì)胞質(zhì)量評價(jià)：

純度鑒定:鏡下觀察、計(jì)數(shù)純化后的細(xì)胞；觀察：心肌細(xì)胞成圓型成纖維細(xì)胞成梭形,計(jì)算：心肌細(xì)胞純度=心肌細(xì)胞數(shù)/(心肌細(xì)胞數(shù)+成纖維細(xì)胞數(shù))×100%。神經(jīng)細(xì)胞：消化：0.1%胰蛋白酶10－5M阿糖胞苷去除膠質(zhì)細(xì)胞。成纖維細(xì)胞建立細(xì)胞株系的最常用來源：以人胚皮膚、幼兒包皮為好消化；胰蛋白酶注意：1.從細(xì)胞生長到第一次傳代需1～2個月左右時(shí)間2.以后傳代7～10天傳1次，3～4天/次（換液〕3.無菌操作減少霉菌的污染;二性霉素抑制霉菌生長，但也能抑制細(xì)胞生長4.如組織塊，絕對避免翻動和振動，否則組織塊不易附著或附著后脫落.干細(xì)胞的培養(yǎng)干細(xì)胞(stemcells)是指來自胚胎、胎兒或成體未分化的具有無限或長期自我維持和自我更新能力的細(xì)胞。兩個基本性質(zhì)：即能夠自我更新和能產(chǎn)生許多分化的后裔。根據(jù)組織來源不同，干細(xì)胞分為：1、胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES)2、成體干細(xì)胞(adultstemcell，AS)。細(xì)胞在體外特定的培養(yǎng)條件下，能連續(xù)傳代，分化為外胚層、中胚層和內(nèi)胚層多種譜系細(xì)胞，保持了正常細(xì)胞的核型和極高的端粒酶活性。

胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)：1、胚胎干細(xì)胞（ES）來自胚胎期桑椹胚的卵裂球或胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellmass，ICM)。2、胚胎生殖干細(xì)胞(embryonicgermcell，EG；germstemcell,GSC)，是負(fù)責(zé)產(chǎn)生配子的一群具有自我復(fù)制能力的細(xì)胞。與ES相似，具有發(fā)育、分化的潛能和特征，但組織來源不同于ES。成體干細(xì)胞的培養(yǎng)成體干細(xì)胞(adultstemcell，As)，是一種存在于不同組織中的未分化的細(xì)胞，并長期保持自我更新的能力，具有分化為該組織特定形態(tài)特征和功能的各種類型細(xì)胞。

成體干細(xì)胞具有可塑性，在特定培養(yǎng)條件下可從一種組織類型分化為另一種組織類型，如造血干細(xì)胞能分化為神經(jīng)干細(xì)胞，盡管其機(jī)制不明，但提示特定的培養(yǎng)細(xì)胞生長的微環(huán)境(niche)對細(xì)胞的分化起著至關(guān)重要的作用。人成體肝臟干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定

肝癌旁組織剪小,4℃Hank’s液反復(fù)沖洗。離心,加入0.05%Ⅳ型膠原酶溶液,37℃恒溫水浴振蕩消化(1h),過200目網(wǎng)濾,離心。用4℃無血清DMEM/F12培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞沉淀,離心。細(xì)胞在含15%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液,接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中,可加入25μg·L-1生長因子濃度,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周以上。

以細(xì)胞長滿瓶底為準(zhǔn).。生長因子作用:肝細(xì)胞生長因子(HGF)、α-成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)及白血病抑制因子(LIF)對肝癌癌旁組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)非常重要,可獲得比較穩(wěn)定的細(xì)胞以便傳代。

人成體肝臟干細(xì)胞鑒定免疫磁珠篩選加抗人C2-kit抗體,4℃,30min。加免疫磁珠20μL,4℃放置15min。加Buffer.安裝免疫磁株架,向磁柱中加入Buffer500μL,清洗磁柱。將細(xì)胞混勻加入磁柱中,磁柱中液體滴入底面放置的無菌試管中;所滴出的細(xì)胞為C2kit-,留在磁柱上的為C2kit+。取下磁柱,將磁柱中的細(xì)胞液(C2kit+)壓入試管中,離心,加入到培養(yǎng)瓶中,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人成體肝臟干細(xì)胞鑒定C2kit+細(xì)胞免疫熒光染色:將多聚賴氨酸包被無菌蓋玻片置于24孔板內(nèi),細(xì)胞爬片,PBS沖洗,固定。第一抗體:加入1:50兔抗人特異性一抗AFP及1:50鼠抗人特異性一抗CK19,過夜。第二抗體:PBS液漂洗。滴加熒光二抗:1:50FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG及1∶100CY3標(biāo)記羊抗兔IgG,37℃孵育30min.漂洗后,熒光顯微鏡下觀察。CY3標(biāo)記的AFP呈紅色顆粒。FITC標(biāo)記的CK19呈綠色顆粒。二者均在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。CK19及AFP在胞質(zhì)內(nèi)有部分重疊,呈黃色熒光。

肝細(xì)胞的標(biāo)志物:AFP、白蛋白,表達(dá)膽管上皮的標(biāo)志物如角蛋白CK7、CK19等,白血病抑制因子(LIF)抑制細(xì)胞分化的目的。二、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

特性：1.與非腫瘤細(xì)胞相比能在某些環(huán)境內(nèi)優(yōu)勢生長。2.形成有缺陷的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。3.體內(nèi)的腫瘤與體外培養(yǎng)的腫瘤差異小。4.具有自我保持“

干細(xì)胞”繁殖無限的代數(shù)。5.腫瘤部位含有非癌細(xì)胞即：間質(zhì)細(xì)胞、被腫瘤侵入的正常組織的殘余細(xì)胞。

1.特點(diǎn)：光鏡：細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯,核糖體顆粒豐富。EM：微絨毛、細(xì)密，微絲走形不規(guī)則。

增殖：癌細(xì)胞在低血清中(2%~5%)仍能生長表明有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子的能力,形成集落克隆能力,增殖數(shù)量,細(xì)胞重疊形成堆積物。浸潤性：是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為,與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)能浸潤入其它組織細(xì)胞中。

異質(zhì)性：同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別。周邊細(xì)胞：血液供應(yīng)增殖干細(xì)胞(stemcells)是支持腫瘤生長的成分易于繁殖。中心處細(xì)胞：細(xì)胞衰老退化，有的處于停滯期。遺傳性：失去二倍體核型，呈異倍體或多倍體。

2、腫瘤細(xì)胞在體外不易生長原因(1)依賴性：雖有較強(qiáng)克隆生長能力，仍有一定的群體性或與其細(xì)胞相依存關(guān)系。(2)分散培養(yǎng)細(xì)胞量影響細(xì)胞增殖的活性。(3)腫瘤干細(xì)胞數(shù)量(4)有些腫瘤細(xì)胞可能需要與體內(nèi)相似的特殊生存條件。

3、如何培養(yǎng)好腫瘤細(xì)胞取材、成纖維細(xì)胞排除，培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物。(1)取材：盡量避免取退變組織，癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、胸腹水是好的培養(yǎng)材料，組織盡快培養(yǎng)，如不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃，不宜超過24小時(shí)。(2)培養(yǎng)基的選擇：RPMI1640、DMEM、mc-coy5A有些腫瘤細(xì)胞需要生長因子，如乳腺癌細(xì)胞。注意：含有血清和相關(guān)生長因子更易培養(yǎng)成功。(3)成纖維細(xì)胞的排除成纖維細(xì)胞>腫瘤細(xì)胞的生長。機(jī)械刮除法：標(biāo)記腫瘤細(xì)胞生長的范圍（畫圈），刮除直至完全刮除掉為止。反復(fù)貼壁法：不加血清培養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的懸液反復(fù)貼壁使兩類細(xì)胞相互分離。4、腫瘤細(xì)胞初代接種可能出現(xiàn)幾種現(xiàn)象完全沒有細(xì)胞移動;有細(xì)胞移動,但無增殖,長時(shí)間處于停滯狀態(tài),有增殖，傳代后停止生長或衰退死亡;

傳了幾代后細(xì)胞緩慢增殖經(jīng)過一段停滯,又旺盛生長，形成穩(wěn)定生長的腫瘤細(xì)胞傳代系;說明：腫瘤細(xì)胞對體外生存條件要求高,不能局限一般培養(yǎng)法可采用一些特殊的措施。

選擇適應(yīng)底物：純化細(xì)胞接種不同底物,如鼠尾膠底層，飼細(xì)胞層。生長因子：加一種或幾種促細(xì)胞生長因子或促生長物、胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。動物體媒介培養(yǎng)：癌瘤嫁動物體內(nèi)取出培養(yǎng)裸鼠最好，瘤塊長大再培養(yǎng)。

第四節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞成功與失敗綜合分析

一、材料選擇：細(xì)胞供給年齡：幼年>老年容易培養(yǎng)同一個體細(xì)胞：分化低>分化高同一個培養(yǎng)物細(xì)胞成分不一,存在異質(zhì)性,分化程度,生物性狀增殖能力,對體外培養(yǎng)適應(yīng)性不同。如皮膚成纖維細(xì)胞大多先生長,干細(xì)胞比非干細(xì)胞易生長增殖。

二、培養(yǎng)條件：細(xì)胞對培養(yǎng)基需求不同,沒有一種培養(yǎng)基是萬能的。應(yīng)選相適應(yīng)的培養(yǎng)基。注意：要想培養(yǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞,應(yīng)了解細(xì)胞生物學(xué)性狀和特殊需要。三、選擇不同貼附的底物四、消化酶選擇膠原纖維多的組織：膠原酶消化上皮組織細(xì)胞：胰蛋白酶五、培養(yǎng)過程污染與排除1、污染

空氣：操作凈化工作臺,工作不帶口罩,外界氣流過強(qiáng),溫度大,含菌

消毒：殘留污物操作：馬虎不準(zhǔn)確，觀念不強(qiáng)

血清：檢測不嚴(yán)，支原體和病毒組織：原代組織有污染，手術(shù)中污染，本身是污染組織（潰爛的腫瘤，碘酒消毒后，擦試不凈。可能混入污染）2、污染對細(xì)胞的影響污染時(shí)間短、輕，及時(shí)排除，細(xì)胞可能恢復(fù)。輕：細(xì)胞生長緩慢、分裂相，細(xì)胞變粗糙，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)。重：停止增殖,分裂相消失,胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓,崩潰并從瓶壁脫落。3、微生物：支原體：無致死毒性，可與細(xì)胞長期共存，對細(xì)胞影響潛在。霉菌：

細(xì)菌：增殖快，短時(shí)間在數(shù)量上壓過細(xì)胞產(chǎn)生毒素殺死細(xì)胞。病毒：真菌：種類繁多，形態(tài)各異，呈白色或淺黃色小點(diǎn)，飄浮于培養(yǎng)液面，肉眼可見。鏡下：呈絲狀或管狀、樹枝狀絲，縱橫交錯穿行于細(xì)胞間。支原體：介于細(xì)菌與病毒之間，能獨(dú)立生活的最小微生物無細(xì)胞壁，形態(tài)多樣，0.2um，可通過濾器圓形絲狀或梨形，在光鏡下很難看清結(jié)構(gòu)。對青霉素普遍有抗藥性。細(xì)胞受到支原體污染后出現(xiàn)以下情況：

嚴(yán)重：細(xì)胞增殖緩慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。輕：無明顯變化，或有微細(xì)變化由于傳代和換液而緩解觀察不夠細(xì)心或缺乏經(jīng)驗(yàn)，檢查不出。

支原體檢測：相差：油浸下觀察，暗色微小顆粒，有類似布朗運(yùn)動，分布細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。值注：支原體與線粒體相似，需加以區(qū)別支原體染色Carnoy固定。低張?zhí)幚淼匾兰t：地依紅2g冰醋酸60ml加水至100ml染色15分鐘脫水封固。光鏡:支原體為暗紫色小體,附細(xì)胞外或散在細(xì)胞之間。Hoechst33258:為DNA特異結(jié)合的熒光探針，支原體DNA能被著色，是檢測支原體最方便、有效的一種方法。醋酸:甲醇（1:3）固定，33258(50g/ml)染色10分鐘，漂洗后觀察。細(xì)胞DNA支原體

常用抗生素用量和效應(yīng)

抗生素

濃度(量/毫升)對象和效應(yīng)

范圍實(shí)用細(xì)菌支原體青霉素10～1000U100U/ml+++鏈酶素10~1000g100g/ml+++#慶大霉素10~200g50g/ml+++#卡那霉素10~1000g100g/ml++#+紅霉素10~100g50g/ml++四環(huán)素5~50g10g/ml++++多粘菌素10~1000g50g/ml++#兩性霉素B1~50g3g/ml++制霉菌素 1~500U50U/ml++截耳素衍10g/ml+++生物(BM-1)四環(huán)素衍生物(BM-2)5g/ml+++4－氟，2－羥基喹啉(CIP)10g/ml+++

工具：微孔濾膜：

能濾除支原體在內(nèi)的粒子，處理受支原體污染的培養(yǎng)液或血清，但不能去掉附于細(xì)胞表面的支原體。藥物：溴尿嘧啶(Bromouracil)支原體的DNA也攝取溴尿嘧啶，用光照射，通過光敏效應(yīng)殺滅支原體。第五節(jié)細(xì)胞觀察活細(xì)胞觀察活性染料固定染色法

一.活細(xì)胞觀察鏡下觀察：細(xì)胞無色透明，倒置顯微鏡或相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)：細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。生長狀態(tài)好:胞內(nèi)無顆粒,不見空氣,胞膜清晰,上清液透明，無懸浮細(xì)胞和碎片。生長狀態(tài)不好：胞質(zhì)出現(xiàn)空氣脂滴和顆粒狀物，細(xì)胞之間的空隙加大細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。1

活性染料：原理：能進(jìn)入活細(xì)胞,一些無毒或毒性很小的染料,電性吸引而堆積在細(xì)胞中某些特定的結(jié)構(gòu)從而顯色,不引起物理和化學(xué)變化,對細(xì)胞生命活動不會產(chǎn)生影響或影響很少。包括：中性紅、結(jié)晶紫、健那綠、次甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、亮焦油紫。特點(diǎn)：它們解離后帶正電荷，屬堿性染料與胞內(nèi)構(gòu)造有一些結(jié)合。

二．固定染色方法1．固定：迅速殺死細(xì)胞再染色進(jìn)行觀察。目的：使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、核酸及糖等轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，避免自溶腐敗。固定的細(xì)胞保持原有結(jié)構(gòu)，保存時(shí)間長。由于固定劑性能不同，如一種固定劑對某種結(jié)構(gòu)保存效果好，但對別的結(jié)構(gòu)就不一定適合，染色劑對細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)成分有不同的親和力，所以每種組織通常有一些特定的固定染色方法。一.常用固定劑包括:1.75％酒精、2.4％多聚甲醛（多聚甲醛為粉末狀，緩慢加入在60℃水浴中溶化），3.甲醛/冰醋酸（冰醋酸1份：甲醛3份），4.FAA（80％乙醇90ml、冰醋酸5ml、中性福爾馬林5ml）5.中性福爾馬林：福爾馬林10ml、Na2HPO4(無水)0.78g、NaH2PO4(無水)0.42g加0.85%NaCl至100ml