第十六章基因工程與蛋白質工程第一節生物工程概述第二節基因工程第三節蛋白質工程第一節生物工程概述一、生物工程概念及研究技術二、在現代工、農、醫領域中的應用一、生物工程的概念及研究技術1.基因工程——在分子水平的遺傳操作技術2.細胞工程——遺傳物質在細胞間的轉移4.生化工程——生物工程產品的最終取得手段3.酶工程——酶的改造和設計基因工程是指在微觀領域（分子水平）中，根據分子生物學和遺傳學原理，設計并實施一項把一個生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉入另一個生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達所需要的產物，最終實現該技術的商業價值。基因工程基因工程與建筑工程基因工程操作水平：DNA分子水平目的：定向改變遺傳物質或獲得基因產物。2、基因工程的理論基礎1）物質基礎——脫氧核苷酸2）結構基礎——規則的雙螺旋結構3）中心法則，共用一套遺傳密碼細胞工程1、細胞工程的概念

利用細胞融合技術把含有不同遺傳物質的細胞合成雜種細胞。并使之分裂生長成為雜種生物。 它包括體細胞融合、核移植、細胞器攝取和染色體片段的重組等。細胞工程操作水平：細胞整體水平或細胞器水平目的：定向改變遺傳物質或獲得細胞產品。2、細胞工程的理論基礎——細胞全能性依據——生物體的每一個干細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質。異種植物細胞雜種細胞轉基因植物異種動物細胞動物細胞群重組細胞體細胞細胞核早期胚胎受精卵去核卵細胞克隆動物試管嬰兒動物細胞融合植物體細胞雜交植物組織培養動物細胞培養核移植胚胎移植體外受精3、主要技術植物組織培養植物體細胞雜交動物細胞培養動物細胞融合單克隆抗體技術胚胎移植核移植植物細胞工程技術動物細胞工程技術酶工程 酶工程是利用酶的特異催化功能，在常溫長壓下將一種物質轉化為另一種物質，以獲得高純度的適用之物。 該技術包括各種酶的開發和生產。酶的分離和純化技術等。酶工程用于食品工業很有效。啤酒、醬油、葡萄糖等都可用酶工程生產。二、生物工工程在現代代工、農、、醫領域中中的應用1.化工及冶金金工業2.輕工和食品品工業4.農業和畜牧牧業3.醫藥工業5.環保和能源源工業稀少珍貴的的蛋白質藥藥物1982年，美國食食品與藥物物管理局批批準了首例例基因工程程產品—人胰島素投投放市場——它標志了基基因工程產產品正式進進入到商業業化階段。。人生長激素素、表皮生生長因子、、腫瘤壞死死因子、a-干擾素、纖纖維素酶、、抗血友病病因子、紅紅細胞生成成素、尿激激酶原、白白細胞介素素-2、集落刺激激因子、乙乙肝疫苗等等等畜牧業中的的應用動物疫苗、、生長激素素等例：從轉基因羊羊的羊奶中中提取出治治療心臟病病的藥物tPA（組織溶解酶酶原激活劑劑）。種植業中的的應用用攜帶外源源基因的農農桿菌Ti質粒轉化植植物原生質質體，使外外源DNA與植物染色色體DNA整合，通過過原生質體體的培養分分化成愈傷傷組織，最最后發育成成具有新性性狀的完整整植株—轉基因植物物基因工程包包括DNA重組技術和和其他使基基因結構得得以定向改改造的技術術。本節主主要介紹DNA重組技術，，大體上包包括下列5個步驟。基因工程是1973年由美國斯斯坦福大學學科恩和舊舊金山大學學醫學院的的博耶創立立的概念第二節基基因工程程DNA重組的技術路路線ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmolecule

Introductionintohostcellsbytransformation

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因因的制備2、載體的構建3、目的基因因與載體的的重組4、重組體體導入宿主細胞進進行擴增5、克隆基因的的鑒定一、目的基基因的獲得得二、基因載載體三、重組DNA的篩選及表表達一、目的基基因的獲得得1.限制酶——特異性切割割DNA的手術刀2.取得目的基基因的方法法——分離法及合合成法1.限制性內切切酶DNA重組即是將兩種種DNA分子經過切切割，選擇擇適合的片片段連接起起來的過程程實現這一步步，是在限限制性內切切酶發現以以后才實現現的限制性內切切酶：一類類核酸內切切酶，可以以將外源DNA在特定位點點切割降解解。以以后從細菌菌中分別分分離出了I型和Ⅱ型兩兩類限制性性內切酶。。限制性內切切酶的命名名用細菌同名名的第一個個字母（大大寫）和種種名的前兩兩個字母（（小寫）構構成酶的基基本名稱。。若酶是從從其中一種種特殊菌株株來，還在在基本名稱稱后加上菌菌株名稱符符號。名稱稱后的羅馬馬數字，表表示在該特特殊菌株中中發現此酶酶的先后次次序。如HaeII是從（Haemophilusaegypticus）中提取的，，并且是從從中發現的的第二個酶酶。限制性內切切酶切割DNA的方式a.從識別序列列的中間切切開b.在識別序列列對稱軸的的左右兩方方進行切割割c.在識識別別序序列列對對稱稱軸軸的的右右邊邊（（5’-3’鏈））和和對對稱稱軸軸左左邊邊（（3’-5’鏈））切切開開a.從識識別別序序列列的的中中間間切切開開從識識別別序序列列的的中中間間切切開開產產生生平平齊齊末末端端（（bluntends）），，如HaeⅢⅢb.在識識別別序序列列對對稱稱軸軸的的左左右右兩兩方方進進行行切切割割即分分別別在在5’-3’鏈和和3’-5’鏈對對稱稱軸軸的的左左右右方方切切開開，，形形成成帶帶有有凸凸出出的的5’磷酸酸基基團團的的粘粘性性末末端端（（Cohesiveends）），，如EcoRⅠⅠc.在識識別別序序列列對對稱稱軸軸的的右右邊邊（（5’-3’鏈））和和對對稱稱軸軸左左邊邊（（3’-5’鏈））切切開開形成成帶帶有有凸凸出出的的3’羥基基的的粘粘性性末末端端，，如如pstI2.取得得目目的的基基因因的的方方法法———分離離法法及及合合成成法法（1）DNA片段段的的直直接接提提取取（2）用用噬噬菌菌體體或或質質粒粒直直接接從從宿宿主主細細胞胞中中將將目目的基基因因攜攜出出（3）使使用用相相應應的的mRNA分離離基基因因二、、基基因因載載體體1.質粒粒———染色色體體以以外外的的遺遺傳傳單單元元2.噬菌菌體體———感染染細細菌菌的的病病毒毒質粒粒是是一一種種環環狀狀雙雙鏈鏈的的DNA分子子。。自自身身在在細細菌菌細細胞胞中中能能不不斷斷復復制制繁繁殖殖。研究究比比較較深深入入的的質質粒粒有有大大腸腸桿桿菌菌的的性性因因子子（（F因子子））、、大大腸腸桿桿菌菌素素因因子子和和抗抗藥藥因因子子等等抗藥藥因因子子（（質質粒粒））在在其其DNA上編編碼碼有有某某些些酶酶的的基基因因，，表表達達產產生生的的酶酶對對鏈鏈霉霉素素、、氯氯霉霉素素、、磺磺胺胺、、青青霉霉素素、、四四環環素素、、卡卡那那霉霉素素等等藥藥物物能能產產生生生生物物化化學學修修飾飾，，使使之之鈍鈍化化而而失失效效1.質粒粒———染色色體體以以外外的的遺遺傳傳單單元元質粒粒的的作作用用質粒粒DNA能從從細細菌菌中中提提出出來來，，又又能能再再轉轉入入細細菌菌。。這這個個過過程程稱稱轉轉化化。。轉轉入入的的質質粒粒DNA仍能進行復制制，這種性能能為DNA重組技術提供供了重要的條條件，即將一一種外源基因因與質粒重組組后，再轉入入細菌中去復復制繁殖，使使外源基因得得以增殖。質粒自身的某某些抗藥基因因成為從轉化化的細菌中篩篩選它們的一一種標記。除除質粒外，噬噬菌體、病毒毒也能通過“感染”將外源基因帶帶入細菌并進進行復制。目前所使用的的質粒目前實驗中所所使用的質粒粒、噬菌體和和病毒載體種種類很多。但但都是經過了了人工改造，，更適宜運用用于DNA重組技術。它它們既保留了了轉化和感染染活細胞的能能力，又具有有多處攜帶外外源DNA的酶切位點，，并含有特殊殊的篩選標記記這些載體中有有些只能復制制擴增帶入的的外源基因；；有些可以使使外源基因復復制、轉錄和和翻譯出基因因的蛋白質產產物，這種載載體稱為表達達載體pBR322質粒的結構以噬菌體或病病毒為載體，，將所需基因因或含有此基基因的DNA片段轉移給受受體細胞的過過程，稱為轉轉導。我們常常采用用噬菌體作為基基因工程的載載體，其一它它的遺傳結構構與功能知道道得比較清楚楚；其二是易易于使細胞感感染，易于使使外源DNA導入宿主細胞胞。2.噬菌體——感染細菌的病病毒以噬菌體為載體體進行DNA克隆DNA用限制性內切切酶除去中間間一段與外源DNA連接重組載體的體體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包包裝頭部前體多聯體DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的顆粒在宿主細胞內進行DNA的裝配過程三、重組DNA的篩選及表達達1.轉化——帶有目的基因因的載體進入入受體細胞2.篩選——從大量受體細細胞選出帶有有重組體的細細胞3.表達——外源DNA在受體細胞的的轉錄和翻譯譯1.轉化——帶有目的基因因的載體進入入受體細胞由質粒作載體體形成的克隆隆，轉入細菌菌時細菌預先先要在低溫條條件下用氯化化鈣處理，形形成“感受態”細胞。即增加加細胞膜的通通透性才能實實現轉化。由噬菌體作載載體的克隆，，轉入細胞的的過程稱為“侵染”。因噬菌體具具有自動侵入入的功能。細細菌不用預先先處理。噬菌體感染大大腸桿菌的途途徑2.篩選——從大量受體細細胞選出帶有有重組體的細胞（1）插入失活法法（2）放射性探針針檢測法（3）R-環檢測法（4）免疫測定法法（1）插入失活法法在現在的基因因工程操作中中，所使用的的載體通常是是經過加工改改造的衍生物物，它們要么么帶有一個或或幾個可供選選擇的遺傳標標記，要么具具有被選擇的的遺傳功能，，這就使帶有有目的基因與與不帶目的基基因的細菌有有明顯區別，，便于篩選。。pBR322質粒結構如果外源DNA插入，氨卞青青霉素抗性基基因失活如果外源DNA插入，四環素素抗性基因失失活（2）放射性探針針檢測法利用mRNA可與相應的DNA段落雜交，來來檢測有外源源DNA插入的重組體體，是一種快快速而靈敏的的方法。（3）R-環檢測法在有利于形成成R-環的條件下，，使待檢測的的純化的質粒粒DNA，在含有mRNA的緩沖液中局局部變性。如如若質粒DNA存在著與mRNA探針互補的序序列，mRNA就會取代DNA中一條鏈，與與另一條鏈形形成雙鏈雜交交分子，從而而形成R-環結構，在電電子顯微鏡下下觀察，可直直接觀察到R-環。這樣可檢檢出重組體質質粒DNA。（4）免疫測定法法免疫法測定只只能是所轉移移外源DNA必須表達后才才能進行，而而且必須具備備有效的特異異性抗體。Southern和Western印跡法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiography3.表達——外源DNA在受體細胞中中的轉錄和翻翻譯帶有目的基因因的載體轉移移到受體細胞胞成功并篩選選出來后，最最終目的是要要目的基因在在受體細胞中中得以表達，，產生具有功功能性的蛋白白質或肽。第三節蛋蛋白質工程一、蛋白質工程的的概念二、蛋白質工程的的一般技術三、蛋白質工程的的應用一、蛋白質工工程的概念蛋白質工程(proteinengineering)：：通過改造與蛋蛋白質相應的的基因中的堿堿基順序，或或設計合成新新的基因，將將它克隆至受受體細胞中，，通過基因表表達而獲得具具有新的特性性的蛋白質技技術1、基因定點點突變——定定做新蛋白質質2、蛋白質設設計——對天天然蛋白質的的修飾蛋白質工程舉舉例：定點突變技術術：已知絲絲氨酸酸是由由TCT編碼，，只要要把C改為G，就變成成半胱胱氨酸酸的密密碼TGT。于是用用人工工合成成一段段寡聚聚核苷苷酸引引物，，引物物里含含有TGT外，其其余均均與基基因部部分互互補。。打開開含有有被突突變蛋蛋白質質基因因的質質粒的的雙條條鏈成成單鏈鏈模板板，用用引物物與之之互補補鏈退退火（（假如如退火火在適適宜溫溫度下下進行行，約約15個堿堿基中中，有有一個個堿基基錯配配是可可以容容忍的的）。。然后后由DNA聚合酶酶延伸伸引物物，由由DNA連接