黃瓜白粉病抗病基因探析緒論,農藝學論文本篇論文目錄導航：【題目】【關于黃瓜白粉病抗病遺傳規律的報道，但是不同學者研究的結果差異很大，尚不統一，總結現有報道可歸納為下面4種觀點：〔1〕隱性多基因控制的數量性狀：1948年，P.G.Smith利用抗性材料PuertoRico37與感病材料雜交，發現F1趨向于感病，在后代F2中的抗感比為1：21，以為PuertoRico37中的白粉病抗性是由多個隱性基因控制。1956年，Barnes等以抗病材料PI197087為研究材料，通過構建遺傳群體進行遺傳分析，以為該抗性材料中含有一或兩個主效基因和一或兩個微效基因功能控制。1995年，呂淑珍等通過研究以為黃瓜中最少3個以上的基因其對白粉病的抗性，并且感病表現為顯性性狀，具有較高的遺傳力。Kooistra(1968)用三個親本構建兩個遺傳群體，分別進行配合實驗，得出黃瓜對白粉病的抗性在兩份不同的抗病材料中分別遭到不同基因的控制：Natsufushinari中含有2個抗病基因此PI2008151中只含有1個隱性的抗病基因，這三個基因均不一樣，在F2后代中表現出超親現象。張素勤〔2005〕用三個抗感雜交組合進行遺傳研究，以為有2個主基因控制黃瓜白粉病抗性，并且遺傳率均很高。〔2〕隱性單基因控制：騰枝國光〔1962〕以為青節成中存在一個隱性的抗病基因。用這種抗病材料與感病材料雜交，F1均表現為感病，F2中抗感分離比為1：3，依此得出其抗性有一個隱性的單基因控制。張桂華〔2004〕也通過構建遺傳分離群體進行遺傳研究，得到了與其一樣的結論。劉龍洲〔2008〕用一對抗感親本構建遺傳群體，進行了苗期接種鑒定，結果后代分離群體〔F2、BCR和BCS群體〕中分離比的結果完全符合孟德爾遺傳規律〔P0.05〕。由此得出結論，在抗病親本中由1個隱性基因控制其抗性，感病性狀為不完全顯性。〔3〕由一對不完全隱性基因和2對上位修飾基因控制，Shanmugasundaram等〔1971，1972〕用對白粉病具有完全抗性的黃瓜種質材料P1212233、P123514分別與感病親本進行雜交，發現F1均表現為感病，F2群體中表現為抗性性狀分離，并且高抗、中抗、感病的單株數之比符合1：3：12，根據孟德爾遺傳分離定律，以為其抗性是由一個隱性主基因s，一個顯性基因R和一個顯性抑制基因I控制。這三個基因各自特點如下：s是主效基因，決定下胚軸抗性,同時也是葉片抗性所必需的；R基因主要影響葉片的抗性，I基由于抑制基因，可使植物表現出不完全抗性，但對s基因的表示出不產生影響。隨后，毛愛軍等〔2005〕、簡德明〔2007〕、王振國〔2007〕等分別以WI2757〔高抗白粉病，美國陸地黃瓜自交系〕與我們國家一份栽培品種進行雜交配置F2為材料進行遺傳分析，研究結果與Shanmugasundaram基本一致。〔4〕由一對隱性基因和一對不完全顯性基因控制，與溫度有關Morishita等〔2003〕發現黃瓜的白粉病抗性由一對隱性基因和一對不完全顯性基因控制，并且抗性遭到溫度的調節。根據其抗性對不同溫度條件的反響不同，將黃瓜材料分成三種類型：高溫〔26℃〕和低溫〔20℃〕下均表現為抗性的品種，如PI197088-5(P)等，在高溫和低溫下均表現為感病的品種，如Sharp〔S〕，第三類就是只在高溫下才表現出抗性的品種，如Natsufushinar〔iN〕。用這三種類型的黃瓜進行相互雜交、自交和回交，并分別進行抗病性鑒定，結果表示清楚：有兩個基因控制黃瓜的抗白粉病性狀aa和BB。只要aaBB這種基因型時，黃瓜才能在高溫和低溫下均表現出抗性，且為完全抗性；當為A_bb時，黃瓜在高溫和低溫下均表現出感病；當為aaB_時，黃瓜會表現出高溫下抗病而低溫下感病。能夠看出，黃瓜的白粉病抗性機制復雜，黃瓜白粉病的抗性規律研究很多而雜，尚未得出統一結論，這嚴重影響下一步白粉病抗性基因的進一步精細定位和克隆。一般以為主要由下面幾個因素造成：首先黃瓜白粉病病原菌具有不同生理小種，不同的研究所用的病原菌有差異;其次，不同研究者進行抗病性鑒定采用的鑒定方式方法不統一，如接種機會、環境條件控制、病情調查時間等，并且多為肉眼觀測，易引入主觀誤差，不同的抗病材料所含有的抗病基因可能不同，抗病機制復雜。所以，不同學者的研究結果千差萬別。1.1.5抗性分子標記與遺傳定位的研究在黃瓜的抗白粉病育種工作中，對材料的抗病性鑒定是影響育種進程最重要的因素，影響白粉病的田間鑒定的環境條件較多，費時費力，一些學者就試圖通過尋找與抗病基因連鎖的分子標記來進行分子輔助選擇育種(MAB),進而提高育種效率。張桂華〔2004〕利用F2分離群體，結合BSA建池法構建抗感池，得到一個AFLP標記，并成功轉化成SCAR標記，連鎖距離為5.56cM。隨后，多位學者也陸續得到了多個與黃瓜白粉病抗性相關基因連鎖的分子標記〔張素勤等，2005；簡德明等，2007；王振國等，2007；張海英等，2006〕。這些分子標記一般都是AFLP或SCAR標記，穩定性較差且遺傳距離相對較遠。張海英(2008)采用SSR分子標記技術，獲得兩個與黃瓜抗白粉病基因連鎖的SSR標記，遺傳距離近期到達了5cM。聶京濤〔2018〕利用BSA建池法獲得一個與白粉病抗病基因連鎖的SSR分子標記SSR15592，遺傳距離為7.62cM。隨著分子生物學的發展，以及黃瓜抗病育種的需求，對白粉病抗性基因的定位研究也愈加深切進入，十分是QTL分析方面，獲得了非常不錯的成果：Sakata〔2006〕利用高抗材料PI197088-1和高感材料Santou作為親本，構建了重組自交系〔RILs〕群體，共檢測到5個與抗白粉病有關的QTL，華而不實只要一個位點在高溫〔26℃〕、低溫〔20℃〕下對抗性均起作用，其他的僅在高溫或者低溫下起作用。這是第一次對不同溫度條件下的抗病基因進行分別QTL定位。劉龍洲〔2008〕利用黃瓜抗病自交系S06與感病自交系S94配置群體，構建了一個F6：7重組自交系，分別與2005年秋和2006年春兩個季度進行了苗期噴霧接種抗病性鑒定和QTL定位分析，以為白粉病抗性屬于數量遺傳，并且鑒定出至少四個QTL位點調控其抗性。這四個QTL位點分別命名為pm1.1,pm2.1,pm4.1和pm6.1，華而不實pm1.1、pm2.1、pm4.1在兩次實驗中均被檢測到。兩季度檢測到的QTL的表型解釋率合計分別到達了52.0%和42.0%。檢測到的位點較多，表型解釋率也較高，但是，這些位點卻沒能與染色體對應。張圣平〔2018〕利用從國內栽培品種中挑選出來的高抗和感病自交系作為親本，構建遺傳分離群體，進行遺傳和QTL定位分析，以為其F2后代群體中抗病性呈連續分布，符合數量性狀遺傳特征，最終檢測到4個QTL位點〔pm5.1、pm5.2、pm5.3、pm6.1〕，分別位于黃瓜5號和6號染色體上，華而不實，除了pm6.1之外，其余三個位點均被重復檢測到，十分的pm5.2的表型解釋率最高，在兩次實驗中分別到達了36.1%和41.6%，對應的LOD值分別到達了15.06和17.88，檢測到多個有價值的QTL位點，并且與染色體物理位置對應，具很高的應用價值。Fukino〔2020〕同樣利用高代重組自交系進行了白粉病的QTL定位，用不同的鑒定方式方法，在不同的季度，不同的溫度下進行了抗病性鑒定，檢測到多個QTL位點，華而不實被重復檢測到的表型解釋率較高的QTL位點有：pm1.2、pm5.2、pm5.3、pm6.1，華而不實pm1.2和pm6.1在四次實驗中均被檢測到，pm5.3被檢測到三次。He等〔2020〕利用F2群體，在不同季度下對子葉、下胚軸、真葉分別進行抗病性調查，并進行了QTL分析，并對前人的研究成果進行了具體的整合。發現除了黃瓜2號染色體上之外，其余的六條染色體均被檢測到QTL存在。華而不實檢測到次數最多的位點位于黃瓜5號染色體〔Chr5〕上。并且發現黃瓜下胚軸的白粉病抗性是由單基因控制，并且定位于5號染色體上。綜上所述，黃瓜白粉病抗性遺傳機制復雜，檢測到的相關基因較多，不同抗病材料所具有的抗病基因不同，并且分布在不同的染色體上。當前研究的結果主要集中在黃瓜5號染色體上，而其他染色體上的抗病基因研究較少，完成全基因組范圍的白粉病抗性基因的挖掘將有利于綜合利用黃瓜種質中的抗性資源。1.2黃瓜白粉病抗病基因挖掘的研究1.2.1植物病原互作形式的研究進展在自然界中，充滿了各種病原菌，包括真菌、細菌和病毒等，這些病原菌與植物的相互作用就會導致植物疾病的發生，如白粉病就是由于真菌〔白粉菌〕入侵植物體造成的。所以植物發病從根本上講是病原菌與植物體之間的相互作用的外在表現。研究發現植物與病原相互作用的形式主要有兩種：基因對基因假講和防衛假講。基因-基因假講：1971年，Flor提出病原與抗病基因分別編碼激發子和激發子受體，若激發子與其相應的受體辨別即可激發植物的抗病反響，表現為抗病，否則表現為感病。這種抗性一般表現為顯性。防衛假講：該假講以為，病原物釋放一種效應因子，這些效應因子能夠作用并修飾植物的某些目的蛋白，植物檢測到這種修飾之后能夠觸發植物對病原的抗病性。防衛假講的提出改變了之前對抗病基因功能的認知，抗病蛋白不僅僅僅是被動的等待與病原蛋白結合，而是主動監視本身的生理變化，迅速啟動防衛反響〔Axtelletal.,2003；Martinetal.2003;王明2020〕1.2.2植物抗病基因的類型。植物中克隆的第一個抗病基因是于1992年在玉米中克隆出來的，至今已有10多種植物中的70多個抗病基因被克隆出來〔Liuetal.,2007〕，通過對這些已克隆的基因的研究發現，大多數抗病基因中存在保守的序列：如富含亮氨酸的重復序列〔LRR〕，核苷酸結合位點構造域〔NBS〕，CC〔coiled-coiled〕構造域等，根據其主要構造域把抗病基因分成了下面幾個大類：1、NBS-LRR類抗病基因，這類抗病基因含有NBS和LRR的構造域。〔Hammond-KosackandParker,2003〕2、胞外LRR受體類，其編碼蛋白包含胞外LRR構造域和單個跨膜區，胞內不編碼激酶。甜菜中的HS1基因〔Caietal.,1997〕3、擬南芥中發現的抗白粉病基因RPW8，其編碼產物為一個攜帶CC構造域的膜蛋白〔Xiaoetal.，2001〕4、大麥抗禾柄銹菌基因Rpg1，其編碼產物為一個帶有兩個激酶構造域的受體激酶類似蛋白(Brueggemanetal.,2002〕5、編碼胞內絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，這類抗病蛋白包含丁香假單胞桿菌基因Pto和PBS1，這兩個基因分別來源于番茄和擬南芥，屬于不同的亞家族。6、編碼胞外LRR類似受體激酶，編碼的蛋白一般包含胞外的LRR構造、單個的跨膜區和胞內的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Songetal.,1995;Gomez-Gomezetal.,2000;Sunetal.,2004)7、Mlo基因：這是從大麥中克隆的一類抗白粉病的隱性基因。其一般包含7個跨膜區，其顯性基因的功能可能是抑制細胞程序性死亡，突變后幾乎對所有白粉病小種具有抗性〔Buschgesetal.,1997〕。綜合以上幾種類型的抗病基因，最重要的是NBS類抗病基因。NBS構造中包含三個關鍵基序：P-loop、Kinase2和Kinase3a。具有結合ATP或GTP及水解酶的活性。NBS構造是基因內互作的關鍵部位，同時也介入不同基因同源構造互作(RathjenandMoffett,2003)。NBS構造突變可顯著影響抗病基因的功能，例如P2基因的NBS構造內保守序列突變后，P2基因基本喪失抗病功能(Doddsetal.,2001)。其次是LRR構造域，LRR構造不盡是抗病蛋白與病原基因產物作用的部位，也決定抗原基因抗性專一性，在信號傳導中也有重要的作用，LRR構造的突變也會顯著影響基因的抗病功能(Dinesh-Kumaretal.,2000；Bryanetal.,2000；Andersonetal.,1997)。有學者揣測LRR區是抗病基因產物和病原基因產物直接或間接作用的部位〔DanglandJones，2001〕。Heetal〔2000〕通過實驗證明LRR決定抗病基因特異辨別的激發子，而胞內激酶決定信號途徑。1.2.3黃瓜抗白粉病基因挖掘的研究固然學者們對黃瓜白粉病抗性基因進行了大量的QTL定位實驗，但是由于定位區域仍然很大，缺少有效的手段進行進一步的精細定位，隨著生物信息學的發展，有的學者開場利用基因的同源性，預測黃瓜中的抗白粉病基因。Yang等〔2020〕在黃瓜中預測了67個NB-LRR類型的抗病相關的同源基因。這些基因分布在黃瓜7條染色體上，華而不實可能有部分與白粉病抗病性有關Schouten〔2020〕利用擬南芥中已經發表的白粉病抗性相關基因和黃瓜基因組測序數據，在全基因組范圍內搜索白粉病抗性基因，最終鑒定出13個MLO-like基因，10個AtPMR4同源基因，一個PMR5同源基因，13個PMR6同源基因。這些基因也是今后挖掘和驗證白粉病抗性候選基因的重點。1.3黃瓜白粉病抗性基因全基因組關聯分析〔GWAS〕全基因組關聯分析〔Genome-WideAssociationStudy〕是一項最早應用于人類疾病研究的技術，Science雜志于2005報道了第一項具有年齡相關性的黃斑變性的GWAS研究〔Klein，2005〕，隨后，陸續發表了一系列應用GWAS研究人類疾病的研究成果。隨著測序技術的發展，測序技術的成熟和測序成本的降低，一些重要形式生物和作物已經完成全基因組測序和重測序工作，所以，一些針對重要的動植物進行的GWAS研究也陸續進行。1.3.1關聯分析的優勢植物中第一個應用關聯分析研究的性狀是玉米中開花時間的基因dwarf8(d8),并隨后在擬南芥和其他作物中得到廣泛應用。關聯分析具有如下優勢：〔1〕不需要構建遺傳分離群體，縮短了研究時間并節約了成本；〔2〕連鎖作圖一般只要兩個親本，只能定位兩個等位基因，而關聯分析能夠實現對一個基因座上多個等位基因的同時研究；〔3〕由于關聯分析使用的是自然群體，所根據的重組是長期進化積累下來的，相對于遺傳群體短時間內的有限次的重組，定位結果的分辨率更高層次，甚至能夠直接找到基因；〔4〕關聯分析使用的標記距離都是以bp為單位，直接與物理位置對應，能夠愈加容易的將定位結果與基因進行整合。〔Liuetal.,2018;王明，2020〕關聯分析以長期重組交換保存下的位點之間的連鎖不平衡〔linkagedisequilibrium,LD〕為基礎，獲得群體表型數據和基因型數據后，用統計學方式方法檢測位點多態性與性狀遺傳變異之間的關聯，可以稱之為連鎖不平衡作圖〔Flint-Garciaetal.,2003〕,LD的衰減程度決定了關聯分析的分辨率。LD衰減較快，關聯的分辨率高，定位基因的準確性也高，相反，LD衰減慢，精度降低，定位區間會相應的加大。1.3.2連鎖不平衡與遺傳連鎖的關系：經常會有人將連鎖不平衡與遺傳連鎖兩個概念混淆，實際上這是兩個完全不一樣的概念，遺傳連鎖是通過計算兩個位點之間的重組率的大小來衡量，考慮的是兩位點之間在染色體上的距離的問題或者講是分布的狀態；而連鎖不平衡分析考慮的是不同的位點之間的相關性，只要兩個位點相對應的等位變異同時出現的概率大于群體中隨機組合的概率，就稱之為連鎖不平衡。由于假如兩個位點在染色體上位置較近，會導致其在群體中更容易同時出現，導致連鎖不平衡，這也是導致人很混淆這兩個概念的主要原因。連鎖不平衡主要來自于兩個因素：自然選擇和基因漂變，但是嚴密的連鎖也會增加連鎖不平衡性。連鎖不平衡的度量本質上是實際觀測到的單倍型頻率與隨機分離時的期望頻率之間的差異。1.3.3植物中影響LD的主要因素作物的交配系統是影響LD的主要因素。異交作物的LD衰減遠小于自交作物。例如玉米栽培種LD衰減距離一般在1.5kb左右(Remingtonetal.,2001)，而玉米自交系中LD衰減距離可到達100Kb〔Rafalskietal.,2002〕。除了交配系統，瓶頸效應也是LD的重要影響因素。作物馴化起始經過中，只要一小部分個體被選擇，基因型頻率收到了很大的選擇，只要小部分基因被保存下來，這種現象稱之為瓶頸效應。這種現象能夠顯著增加LD的水平。另外研究群體的大小也是影響LD的重要因素，不難想象，假如群體過小，很容易使估測的LD過大。1.3.4關聯分析的一般步驟：關聯分析大體上需要經過下面幾個步驟：群體構建、表型鑒定和基因型檢測、群體構造分析、關聯分析。詳細如下：群體構建時一般需要考慮兩個方面：群體大小和材料多樣性，一般來講群體越大，多樣性越好，研究的結果也會越好，但是成本也會增加，一般先用分子標記對種質資源進行多樣性挑選，挑選出代表最廣泛多態性的最小群體。這樣挑選出來的群體我們能夠稱之為核心種質。例如本實驗所用的關聯分析材料為黃瓜核心種質，是由從3342份種質中挑選出來的115個株系組成,代表了總遺傳多態性的77.2%〔Qietal.,2020〕。表型的鑒定與變異分析：對于植物實驗，十分是材料是純合自交系，一般采取多年多點的重復鑒定來增加表型鑒定的準確性和穩定性。另外某些復雜性狀有多個指標對其進行評估，比方黃瓜果實大小，能夠包括長、直徑、果重等能夠通過主成分分析法，減少實驗數據的采集量，找出能夠代表目的性狀表型的主成分因子，用其多為表型數據進行關聯分析。基因型的測定：隨著二代測序技術的成熟，SNP分子標記被大量的用在關聯分析上，其具有下面方面的優勢：〔1〕標記數量多、密度大，有研究表示清楚玉米和大芻草中，編碼區每124bp就存在一個SNP位點，非編碼區每31bp就有一個SNP位點；〔2〕檢測技術成熟，包括芯片技術和二代測序技術的成熟和廣泛應用，使SNP標記的檢測成本降低的同時也愈加快速(汪維鵬等，2006)。群體構造和親緣關系分析就是對群體中的個體進行組成分析，把所有的材料分成不同的亞群，這樣能夠避免一樣亞群內部LD強度偏大導致的假陽性。關聯分析所用的群體一般有如下五種：a、理想群體，具有較弱的群體構造和親緣關系；b、多家系群體，群體構造微弱但是包含多個家系；c、具有群體構造但是親緣關系較遠；d、既有群體構造又有親緣關系；e、具有高度群體構造和嚴密親緣關系的群體。一般來講做植物，十分是農作物多數屬于第四種群體構造，所以必須進行群體構造和親緣關系的分析。進行群體構造和親緣關系分析需要用到覆蓋全基因組的分子標記，常見的如SSR、SNP等，一個SSR分子標記常有多種基因型，而數量較少；每個SNP位點一般只要兩個基因型，但是數量宏大。所以假如是等量的分子標記的話，SSR標記檢測的效率更高層次〔Zhuetal.，2008〕表型與基因型的關聯分析：Tassel是關聯分析常用的軟件，關聯分析所用的模型主要有GLM〔一般線性模型〕和MLM〔混合線性模型〕。GLM模型：y=markereffect+populationstructure+residual。在Tassel軟件中的GLM程序中將各個個體的Q值作為協變量，對標記分別與性狀進行回歸分析，計算量較少，運行時間短。MLM模型需要先計算每個品系歸屬于各個亞群后Q矩陣和品系間親緣關系K矩陣。用以矯正群體構造和遺傳背景對檢測結果的影響，運行時間較長。1.3.5關聯分析在黃瓜研究中的應用關聯分析已經在重要的糧食作物中獲得了豐富的成果，如以下出了在形式作物和重要糧食作物中獲得的一些重要的研究進展：在擬南芥研究中的應用：Aranzana等通過GWAS技術鑒定出擬南芥中控制開花時間和抗性