會計學1Westernblot實驗介紹及流程Bio-rad垂直電泳、電轉裝置目的與要求

掌握垂直電泳、電轉的基本原理與操作步驟培訓內容

熟悉western-blot與SDS的基本原理與實驗流程考核題目第1頁/共17頁電泳槽玻璃板、梳子、加樣校準架等電轉移槽切膠板、黑白夾板、海綿墊等電泳儀

Bio-rad垂直電泳、電轉裝置用途：用于生物學實驗中對特定目的蛋白質的分離，定性及定量的檢測分析，是Western-blot（蛋白免疫印跡）實驗中非常重要的部分。

第2頁/共17頁Westernblot是利用已知的特異性抗體與抗原（即組織細胞中的目的蛋白）能特異性結合的原理，通過化學反應使標記于結合后的特異性抗體上的顯示劑（如酶、金屬離子、同位素）顯示一定的顏色或發光來對組織細胞內目的蛋白定性及半定量的研究。Westernblot實驗原理抗原一抗生物素標記的二抗ECL發光試劑第3頁/共17頁Westernblot檢測蛋白表達實驗流程提取總蛋白蛋白濃度測定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳ECL檢測封閉二抗一抗洗滌洗滌掃描分析轉膜第4頁/共17頁

SDS電泳技術首先在1967年由Shapiro建立,1969年由Weber和Osborn進一步完善。

SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳，是在PAGE凝膠中引進SDS（十二烷基磺酸鈉，含有大量帶負電荷的SO32-），SDS能破壞蛋白質分子的二級、三級結構，在含有強還原劑的溶液中可與蛋白質形成SDS-蛋白質復合物（電泳樣品加入樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘）。由于結合大量帶負電荷的SDS，好比蛋白質穿上帶負電的“外衣”，蛋白質本身帶有的電荷則被掩蓋了，從而起到消除各蛋白質分子之間自身的電荷差異的作用，蛋白質在SDS膠中的遷移率主要取決于其分子量的大小。

SDS電泳的基本原理第5頁/共17頁1AproteinsampleissubjectedtoelectrophoresisonanSDS-polyacrylamidegel.Westernblot實驗流程第6頁/共17頁SDS電泳操作步驟（1）配制分離膠

注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速灌膠（2）灌分離膠

灌膠之上輕輕加一層水或正丁醇液（3）配制濃縮膠

注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速用滴管灌膠（4）灌濃縮膠倒掉分離膠上的水或正丁醇之后，倒置吸凈殘留溶液，灌注濃縮膠，將梳子插好,膠凝固好后有膠條的國產槽需要去掉膠條（濃縮膠與分離膠一般比例為1：3）（5）加Tris-甘氨酸電泳緩沖液

足量（6）上樣

蛋白質含量要適量，上樣總體積要適量（7）電泳

50V1h,100V2.5h，根據分子量的大小確定電壓和時間，一般溴酚藍離膠下１cm停止電泳，上槽接負極，下槽接正極

第7頁/共17頁第8頁/共17頁2Electroblottingtransferstheseparatedproteinsfromthegeltothesurfaceofanitrocellulosemembrane.Westernblot實驗流程第9頁/共17頁（1）剝膠

用切膠板切去濃縮膠和多余的分離膠（2）準備濾紙和硝酸纖維素膜切濾紙和膜時一定要戴手套，大小與膠一致

（3）浸泡濾紙、膜和海綿墊

用轉移液（含甲醇）浸泡，開門通風（4）制備“三明治”制備每一層時注意趕氣泡（5）電轉

75V，1.5h，在冰浴中進行，黑板對黑極（－），白板對白極（＋）電轉操作步驟第10頁/共17頁4Anantibodythatisspecificfortheproteinofinterest(theprimaryantibody-Ab1)isaddedtothenitrocellulosesheetandreactswiththeantigen.

Onlythebandcontainingtheproteinofinterestbindstheantibody,formingalayerofantibodymoleculesWesternblot實驗流程一抗孵育：必須選擇可以抗抗原種屬的一抗。如做大鼠目的蛋白的檢測，則我們選擇的一抗可以是來自兔、人、小鼠的抗大鼠的抗體。一抗濃度及孵育時間、溫度很重要。3Theblotisincubatedwithagenericprotein(suchasmilkproteinsorBSA)whichbindstoanyremainingstickyplacesonthenitrocellulose.第11頁/共17頁5Followingseveralrinsesforremovalofnon-specificallyboundAb1,theAb1-antigencomplexonthenitrocellulosesheetisincubatedwithasecondantibody(Ab2),whichspecificallyrecognizes

theFcdomainoftheprimaryantibodyandbindsit.Ab2isradioactivelylabeled,oriscovalentlylinkedtoareporterenzyme,whichallowstovisualizetheprotein-Ab1-Ab2complex.Westernblot實驗流程

二抗孵育：二抗的選擇根據一抗的種屬來源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗體，則二抗應選擇山羊或其他來源抗兔的抗體，而且二抗要標記有同位素或酶。第12頁/共17頁Westernblot實驗流程6ECLdetectionECLKitisbasedontheenzyme-linkedimmunodetectionofantigen-specificantibodyusinganti-IgGsecondaryantibodiesconjugatedtohorseradishperoxidase(HRP),whichreactswithachemiluminescentsubstrateinthepresenceofachemicalenhancer.ECL顯色：ECL試劑與過氧化物酶結合后發光后，可用儀器自動檢測或在暗室內用X-光片將其記錄下來。第13頁/共17頁Westernblot實驗結果與分析

c-fosactin62kD42kD將X-光片在凝膠圖像分析儀上進行灰度掃描，比較目的蛋白與內參照蛋白的灰度值，可得到蛋白表達半定量分析結果第14頁/共17頁考核題目1.Bio-rad垂直電泳、電轉裝置的主要用途是什么？2.Bio-rad垂直電泳、電轉裝置主要由哪幾部分構成？3.