實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作（一）PCR簡介1.即聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）誕生于1985年，是根據(jù)生物體內(nèi)DNA復制的某些特點而設(shè)計的在體外對特定DNA序列進行快速擴增的一項技術(shù)。美國Cetus公司的KaryMullis發(fā)明了該技術(shù)（1993年諾貝爾化學獎）。2.操作過程的簡化依賴于以下兩項技術(shù)：1）熱穩(wěn)定性TaqDNA聚合酶的應(yīng)用；2）自動化熱循環(huán)儀的設(shè)計成功。3.該項技術(shù)對分子生物學及其相關(guān)學科的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等產(chǎn)生了革命性的影響。實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作體內(nèi)DNA復制過程的體外模擬實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作（二）基本原理1．PCR的特征： 能大量擴增特定序列，引物結(jié)合位置將決定擴增的DNA序列。2．PCR包括3個熱循環(huán)過程：1）雙鏈DNA的高溫變性（解鏈）；2）引物與模板的低溫退火（引物與模板結(jié)合）；3）適宜溫度下的引物延伸（互補鏈的合成）。PCR擴增時，靶DNA序列產(chǎn)量隨著循環(huán)次數(shù)呈指數(shù)增加，從而達到迅速大量擴增的目的。實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作3.擴增過程熱預變性高溫變性適溫延伸低溫退火補償延伸實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作4.PCR原理：第一循環(huán)引物模板DNA雙鏈模板DNA單鏈實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作前兩個循環(huán)實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作前三個循環(huán)目標分子實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作計算表明：用基因特異性引物擴增目的基因時，若假設(shè)開始模板分子數(shù)為x，經(jīng)過n個循環(huán)后，目的分子個數(shù)為x(2n-2n)實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作(三)反應(yīng)體系模板DNA；引物對；4種脫氧核苷三磷酸；耐熱DNA聚合酶；適宜的緩沖液。實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作1．模板DNA(template)：單鏈DNA或雙鏈DNA，cDNA注意事項：1）用DNA粗制品做樣品，應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)等；2）要被擴增的DNA特定序列不需要事先從樣品中分離純化，因為PCR產(chǎn)物的序列，即反應(yīng)的特異性，是由寡核苷酸引物序列所決定的。

3）PCR所需的DNA模板量較低。實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作2．引物：primer1)概念：是指兩段與待擴增靶DNA序列側(cè)翼片段互補的寡核苷酸。引物序列決定了PCR擴增片段的長度、位置和結(jié)果。2）引物設(shè)計上的基本原則：a:一般為20~30bp；b:G+C含量：應(yīng)在45%~55%之間；c:堿基分布的隨機性；d:引物自身：不能含有自身互補序列；e:引物之間：兩個引物之間不形成引物二聚體；f:特異性：與非特異擴增序列的同源性應(yīng)小于10%，或少于連續(xù)8個互補堿基；g:引物的3’端：3’端不應(yīng)發(fā)生錯配；實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作3．4種dNTPs：靶DNA序列的擴增原料。注意事項：1）dNTPs貯存液pH值應(yīng)為7.0；2）每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50~200μmol/L為宜。3）4種dNTPs的濃度應(yīng)相同。實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作4．DNA聚合酶1）Klenow片段：又叫Klenow聚合酶或polI大片段酶。 它能識別和消除錯配的引物末端，以校正復制過程中錯配的核苷酸。缺點：反應(yīng)溫度為37℃2）TaqDNA聚合酶：最初是從美國黃石國家公園的一個溫泉中發(fā)現(xiàn)的一種嗜熱菌——水生棲熱菌（Thermus

aquatics）YT菌株中分離而得。此酶的最適作用溫度為72℃。實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作（四）循環(huán)參數(shù)1．變性溫度和時間 原則上變性步驟應(yīng)高溫，短時，既要保證變性充分，又要保持聚合酶在整個反應(yīng)中的活性。2．退火溫度： 退火溫度和時間取決于引物的長度、堿基組成及其在反應(yīng)體系中的濃度。通常反應(yīng)條件為55℃。3．引物延伸1）引物延伸溫度：TaqDNA聚合酶通常為72℃。2）延伸步驟的時間：1000bp/min。4．循環(huán)次數(shù)：一般為25-40個周期。實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作（五）PCR擴增儀1．機械自動裝置：固定溫度控制部分，依據(jù)每一個保溫階段對溫度的要求，將樣品在三個控溫部分之間模擬手工操作進行機械移動。

左到右有三個恒溫水浴鍋95度52度72度實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作2．溫度循環(huán)裝置：整個PCR過程中，樣品在樣品臺上保持相同的物理狀態(tài)，而用一軟件控制的加熱/冷卻系統(tǒng)進行調(diào)控，實現(xiàn)周期性溫度改變及恒溫過程的自動化。實驗目掌握PCR原理熟悉PCR基礎(chǔ)操作（六）實驗操作1.標準的PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建（總體積：20.0μl）反應(yīng)體系標準加入量（μl）實際加入量（μl）10×buffer2.064×dNTPs（10μMeach）0.44模板1.01正向引物0.83