纖維連結(jié)蛋白在腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中的表達(dá)及意義程紅新1楊曉萍1蔣雅紅3林智峰1趙瑾2陶林2新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，1第一附屬醫(yī)院腎病科，2病理科，3第三附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，新疆維吾爾自治區(qū)石河子市832008摘要：背景：纖維連結(jié)蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)表達(dá)增加在腎間質(zhì)纖維化疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著的重要作用。目的：探討纖維連結(jié)蛋白在腎間質(zhì)纖維化（RIF）大鼠腎組織中的表達(dá)及作用。方法：72只SD大鼠隨機(jī)摸球法均分為正常組、對(duì)照組和模型組。造模組建立單側(cè)輸尿管梗阻模型；對(duì)照組僅進(jìn)行假手術(shù)；正常組不做任何處理。分別于造模后第1，3，7，14天分批處死大鼠，檢測(cè)大鼠梗阻側(cè)腎小管間質(zhì)纖維化損傷程度并檢測(cè)腎臟組織中纖維連接蛋白（FN）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的表達(dá)。結(jié)果與結(jié)論：與正常組及對(duì)照組比較，梗阻時(shí)間越長(zhǎng)，腎小管間質(zhì)損害程度越重，纖維化越明顯。造模后1d大鼠腎臟組織FN、MMP-9表達(dá)水平即出現(xiàn)上調(diào)，造模后3d，TGF-β1表達(dá)水平出現(xiàn)上調(diào)，并均于第14天達(dá)最高水平，與同期正常組、對(duì)照組相比，差異有顯著性意義（P<0.05）。說明在大鼠UUO腎纖維化形成過程中，F(xiàn)N的蛋白表達(dá)在腎損傷早期即顯著增加，并隨腎間質(zhì)纖維化程度加重而逐步升高，從而促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生。而MMP-9的高表達(dá)可能是加重腎間質(zhì)損害的因素之一。關(guān)鍵詞：?jiǎn)蝹?cè)輸尿管梗阻模型；纖維連接蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；腎間質(zhì)纖維化TheexpressionanditssiginificanceofFibronectininRatsatkidneywithRenalInterstitialFibrosisCHENGHong-xin,YANGXiao-ping,ZHAOJin，TAOLin(DepartmentofNephrology,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziMedicalUniversity,Xinjiang832000,China)AbstractBACKGROUND:TheincreasingoftheexpressionofFibronectinplayedtheimportantroleintheprocessoftherenalinterstitialfibrosis.OBJECTIVE:Toinvestigatetheexpressionandtheeffectsoffibronectin(FN)inRatsatkidneywithrenalinterstitialfibrosis(RIF).METHODS:seventy-twomaleSprague-Dawley(SD)ratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup（n=24）、sham-operationgroup(n=24)andUUOmodelgroup(modelgroup，n=24)bytouchingballmethod．RatsinthemodelgroupwerepreparedforUUOmodel,thesham-operationgroupwereonlypreparedforsham-operatio,andthenormalchtrolgroupwerepreparedfornothing.Ratsineverygroupweresacrificed1，3，7and14dafteroperation(aftermodelestablishmentformodelgroup)(n=6foreachtime)，HEstaining，Massonstaining，andimmunohistochemicalstainingwereusedtoevaluatethedegreeofrenaltubulointerstitialfibrosis(obstructedsideformodelgroup)anddetecttheexpressionofFN、MMP-9andTGF-β1inrenaltissues．RESULTSANDCONCLUSION:Histologicalobservationsofrenaltissuesrevealedthatthedegreeofrenaltubulointerstitialfibrosisofratsinmodelgroupwassignificantlyincreasedascomparedwiththenormalgroupandsham-operatedgroupafterUUO,anditwasincreasedgraduallyaccompanyingwiththeincreasingofdegreeofobstruction.ItwasindicatedbyimmunohistochemicalstainingthattheexpressionofproteinofFNandMMP-9ofrenaltissueinmodelgroupbegantoincreaseonthefirstdayafterUUO，andtheexpressionofTGF-β1increasedonthethirddayafterUUO，theyallreachedthemaximumat14thdaywhencomparedwiththenormalgroupandsham-operatedgroup,Significantdifferencewasassumedatp<0.05.ItwasindicatedthatintheprocessoftherenalinterstitialfibrosisinUUOrats，theexpressionofproteinofFNwaselevatedfromtheearlystageandpositivelyassociatedwithfibrosisstage，andthenpromotedtherenalfibrosis.ThehigherproteinexpressionofMMP-9mightbeoneofreasonsforinducingtherenalinterstitialfibrosis.KeyWords:Unilateralureteralobstruction（UUO）model;FN;MMP-9;TGF-β1;Renalinterstitialfibrosi引言近年來，大量研究證明[1,2]，各種腎臟疾病腎功能的損害程度與腎小管間質(zhì)纖維化程度密切相關(guān)，腎小管間質(zhì)病變程度是反映腎功能下降嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后的最重要指標(biāo)。腎間質(zhì)纖維化的過程涉及多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑，并有多種生物活性物質(zhì)參與期間，其中細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）產(chǎn)生增加和（或）降解減少所導(dǎo)致的ECM異常積聚，在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生和進(jìn)展過程中具有重要的作用[3]。探討ECM的異常積聚，對(duì)全面認(rèn)識(shí)腎間質(zhì)纖維化疾病本質(zhì)有著重要意義。腎臟組織中ECM的成分主要是FN、Col-Ⅳ等，降解ECM最重要的酶系之一就是基質(zhì)金屬蛋白酶，本文將從腎間質(zhì)纖維化過程中Fn的蛋白表達(dá)變化及明膠酶（MMP-9）活性水平等進(jìn)一步探討腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制，以及Fn在腎間質(zhì)纖維化發(fā)病中的作用及意義。1材料和方法設(shè)計(jì)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察。時(shí)間及地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)于2010年7月-2011年5月在新疆地方與民族高發(fā)病省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。材料：健康雄性8周齡SD大鼠72只，體質(zhì)量(200±12)g，由新疆醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(新)2003-0001。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[4]。方法：?jiǎn)蝹?cè)輸尿管梗阻模型的建立及分組干預(yù)：將動(dòng)物隨機(jī)摸球法均分成正常組、假手術(shù)對(duì)照組和單側(cè)輸尿管梗阻模型組。模型組采用10%水合氯醛3.0mL/1kg腹腔注射麻醉，在劍突下一橫指處，沿腹直肌外緣處切開SD大鼠皮膚及肌層，進(jìn)入腹腔，在左側(cè)脊椎旁找到左側(cè)腎臟，在近左腎下極處游離并進(jìn)行雙結(jié)扎SD大鼠左側(cè)輸尿管，造模后逐層縫合肌肉、皮膚，造模手術(shù)參見文獻(xiàn)[5]。對(duì)照組僅開腹游離左側(cè)輸尿管，不結(jié)扎；正常組不做任何處理。3組大鼠均常規(guī)喂養(yǎng)，并于造模后分別在第1，3，7，14天各處死每組6只大鼠，取左側(cè)腎臟分成2份，一份固定于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液，一份置于-80℃液氮中。腎臟病理檢查：常規(guī)石蠟包埋，切片厚3μm，行蘇木精-伊紅（HE）染色后光鏡下觀察腎臟組織病理改變。計(jì)算腎間質(zhì)纖維化指數(shù)(%):RIF指數(shù)=(纖維化面積/腎小管間質(zhì)總面積)×100，依據(jù)RIF指數(shù)進(jìn)行分級(jí)[6]。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎臟組織FN、MMP-9和TGF-β1的蛋白表達(dá)：按照即用型非生物素免疫組織化學(xué)EliVisionTMplus試劑盒(福建邁新生物技術(shù)公司)說明書要求進(jìn)行操作。兔抗鼠FN多克隆抗體、兔抗鼠MMP-9多克隆抗體，購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體，購(gòu)于SantaCruz公司。由二位病理科醫(yī)師獨(dú)立觀察染色陽性細(xì)胞進(jìn)行結(jié)果判定，并計(jì)算其平均值：高倍鏡下（×400）隨機(jī)選5個(gè)小管間質(zhì)視野（避開腎小球和大血管）觀察染色細(xì)胞的面積和強(qiáng)度，計(jì)算其平均值。染色面積：0分為無染色，1分為偶有染色，2分為局灶染色，3分為彌漫染色。染色強(qiáng)度：0分為無染色，1分為淡黃色，2分為黃色，3分為棕黃色。總積分1分為陰性，2-3分為弱陽性，4-5分為陽性，6分為強(qiáng)陽性。主要觀察指標(biāo)：①腎組織病理學(xué)變化。②纖維連接白、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的蛋白表達(dá)。②相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)均采用±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。組間及同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)比較采用方差分析，F(xiàn)N、MMP-9、TGF-β1與腎間質(zhì)病變積分之間的相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析，P<0.05表示差異有顯著性意義。2結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析：實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠72只，分為3組，無脫失，均進(jìn)入結(jié)果分析。2.2腎臟病理改變：光鏡下觀察，HE染色，與正常組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，對(duì)照組第1，3，7，14d的腎組織未見明顯異常，單側(cè)輸尿管梗阻模型組于造模后第1天在腎小血管及腎間質(zhì)周圍可見有少量炎性細(xì)胞呈小灶性浸潤(rùn)；造模后第3天模型組可見腎間質(zhì)水腫，腎小管擴(kuò)張，小管間質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)較多單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，腎臟損傷逐漸加重，至第14天腎小管結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，腎小管萎縮，管腔塌陷，上皮細(xì)胞大量壞死，部分腎小管、集合管擴(kuò)張呈囊狀，腎間質(zhì)彌漫性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增生及膠原形成，腎間質(zhì)纖維化明顯。造模組與正常組、對(duì)照組相比，腎間質(zhì)損害評(píng)分有顯著性差異，見表1，圖1.1-1.3，圖2.1-2.3。表1各組不同時(shí)間腎小管間質(zhì)損害程度評(píng)分(±s，RIF指數(shù))Table1tubulointerstitialdamagemarkindifferenttimeofeachgroup(±s，RIFindex)t（afterUUO）UUOmodelsham-operationnormalcontrolFP1d0.345±0.2970.064±0.1060.000±0.0005.9210.053d1.720±0.3570.263±0.2080.000±0.00084.6550.057d2.427±0.4310.634±0.2330.000±0.00058.2400.00114d2.878±0.1810.865±0.2430.000±0.00046.0250.000F66.56518.57———P0.0010.05———圖1.1正常組3天(×400)圖1.2:假手術(shù)組3天(×400)圖1.3:UUO組3天(×400)Fig1.1ThechangeofkidneyFig1.2ThechangeofkidneyFig1.3Thechangeofkidneyhistopathologyinnormalhistopathologyinsham-histopathologyinUUOmodelcontrolgroupatthethirdoperationgroupatthethirdgroupatthethirddayday(HEStain，×400)day(HEStain，×400)(HEStain，×400)圖2.1正常組14天(×400)圖2.2:假手術(shù)組14天(×400)圖2.3:UUO組14天(×400)Fig2.1ThechangeofkidneyFig2.2ThechangeofkidneyFig2.3Thechangeofkidneyhistopathologyinnormalhistopathologyinsham-histopathologyinUUOmodelcontrolgroupatthefour-operationgroupatthefour-groupatthefourteenthteenthday(HEStain，×400)teenthday(HEStain，×400)day(HEStain，×400)2.3大鼠腎臟組織FN、MMP-9和TGF-β1的蛋白表達(dá)：在正常組及假手術(shù)對(duì)照組腎組織中FN僅有微量表達(dá)，但模型組大鼠在造模后第1天開始，腎組織中FN表達(dá)面積即明顯增多（1.43±0.08），且隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，腎組織中FN表達(dá)面積呈持續(xù)增加趨勢(shì)，至UUO術(shù)后第14天FN表達(dá)達(dá)到高峰，與同期正常組、對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2，圖3。MMP-9蛋白在正常組及對(duì)照組腎組織中僅有極微量表達(dá)，模型組大鼠在造模后第1天腎組織中MMP-9蛋白表達(dá)即開始增加，第14天達(dá)到高峰，與同期正常組及對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表3，圖4。TGF-β1在正常組及對(duì)照組腎組織中有很少量表達(dá)，模型組大鼠于造模后第3天腎組織中TGF-β1蛋白表達(dá)出現(xiàn)明顯增加，至第14天達(dá)高峰，與同期正常組及對(duì)照組相比,具有顯著性差異(P<0.001)，TGF-β1在對(duì)照組第7天開始也有了較強(qiáng)表達(dá)（1.201±0.356），至第14天達(dá)到高峰，與同期正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表3，圖5。表2各組大鼠腎組織不同時(shí)間FN表達(dá)的比較（n=6,±s）Table2ThecomparisonoftheexpressionofFNindifferenttimeofeachgroup（n=6,±s）Group1d（afterUUO）3d（afterUUO）7d（afterUUO）14d（afterUUO）FPnormalcontrolsham-operationUUOmodelFP0.18±0.050.43±0.171.43±0.0865.8330.0000.21±0.020.60±0.133.37±0.15581.4130.0000.23±0.010.93±0.356.10±0.41436.5030.0000.19±0.070.60±0.182.47±0.163560.5930.000—5.042414.028———0.0090.000——表3各組大鼠腎組織不同時(shí)間MMP-9表達(dá)的比較（n=6,±s）Table3ThecomparisonoftheexpressionofMMP-9indifferenttimeofeachgroup（n=6,±s）t（afterUUO）UUOmodelsham-operationnormalcontrolFP1d1.20±0.4190.47±0.1210.45±0.17614.8950.003d3.53±0.1630.53±0.0820.45±0.1221149.1380.007d4.70±0.2760.53±0.1410.45±0.152819.7300.0014d5.73±0.1630.62±0.1790.46±0.121556.0830.00F381.551.170.02——P0.000.3470.996——表4各組大鼠腎組織不同時(shí)間TGF-β1表達(dá)的比較（n=6,±s）Table4ThecomparisonoftheexpressionofTGF-β1indifferenttimeofeachgroup（n=6,±s）t（afterUUO）UUOmodelsham-operationnormalcontrolFP1d0.315±0.1930.231±0.2330.132±0.1621.3320.053d1.902±0.4830.303±0.3500.132±0.16244.2940.057d2.512±0.5040.868±0.2430.132±0.16260.6730.00114d3.701±0.2741.201±0.3560.132±0.162261.5310.001F86.89414.137———P0.0010.001———2.4相關(guān)性分析：纖維連接蛋白、基質(zhì)蛋白酶-9、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1與腎小管間質(zhì)病理損害程度呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.899，0.934，0.893，P<0.001）；纖維連接蛋白、基質(zhì)蛋白酶-9、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1三者蛋白表達(dá)之間的相關(guān)關(guān)系也呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.962，0.902，0.868，P<0.001）。3討論纖維連接蛋白(FN)是一種非膠原性的a2糖蛋白，其參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘連;維持細(xì)胞的正常形態(tài);作為細(xì)胞間基質(zhì),損傷后作為基質(zhì)再生支架調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng),促進(jìn)細(xì)胞遷移;對(duì)單核-巨噬細(xì)胞有趨化作用;參與止血與血液凝固;通過調(diào)理作用增加吞噬細(xì)胞的吞噬能力等[7]，在人體的發(fā)育、細(xì)胞分化與移行、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程以及炎癥損傷修復(fù)、免疫應(yīng)答、腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程中起著重要作用。這種a2糖蛋白可由成纖維細(xì)胞以及肝細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞來合成，為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要組成成分。纖維連接蛋白能夠結(jié)合纖維蛋白、纖維蛋白原及膠原，是其它膠原沉積于腎小管和間質(zhì)的先決條件之一，可能是作為這些細(xì)胞外基質(zhì)成分之間的中心環(huán)節(jié)而起作用，同時(shí)纖維連接蛋白也是一種重要的調(diào)理介質(zhì)，其通過與整合素的結(jié)合在介導(dǎo)細(xì)胞增值與器官硬化過程中起著重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在正常組及假手術(shù)對(duì)照組的大鼠腎間質(zhì)中FN僅有微量表達(dá)，但在模型組中,FN的蛋白表達(dá)則明顯增多，且隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，腎間質(zhì)纖維化(RIF)程度的加重，F(xiàn)N的蛋白表達(dá)持續(xù)增加。通過線性相關(guān)分析我們觀察到，UUO模型組中FN的蛋白表達(dá)量與腎間質(zhì)損害程度呈顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)r=0.899，P<0.001，證實(shí)了FN合成的顯著增加是腎間質(zhì)纖維化的主要表現(xiàn)，并促進(jìn)了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。我們的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，UUO模型組造模后第1d，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)即顯著增加,特別在腎小球周圍的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)更為明顯，且隨著腎小管間質(zhì)損害的加重，MMP-9的表達(dá)量進(jìn)行性增加,并于術(shù)后第14d達(dá)高峰。這與KimH等[9，10，11]的研究結(jié)果相一致。通過線性相關(guān)分析我們發(fā)現(xiàn)，UUO模型組中MMP-9的蛋白表達(dá)量也與腎間質(zhì)損害程度呈顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)r=0.934，P<0.001。FN與MMP-9的蛋白表達(dá)量之間亦呈顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)r=0.962，明顯高于其他相關(guān)比，這表明FN的蛋白表達(dá)升高與MMP-9表達(dá)升高有著密切關(guān)聯(lián)。研究證實(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物是調(diào)控ECM降解最重要的酶系[12]，基質(zhì)金屬蛋白酶的主要功能就是降解ECM成分。國(guó)內(nèi)楊曉萍等[13，14]的研究證實(shí)，UUO模型大鼠術(shù)后會(huì)出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）現(xiàn)象，我們推測(cè)梗阻時(shí)間越長(zhǎng)，小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化就越多，合成的ECM就越多，刺激MMP-9代償性增加就越嚴(yán)重，MMP-9蛋白表達(dá)增加促使基底膜成分降解，腎小管基底膜斷裂,造成更多的腎小管上皮細(xì)胞損傷，侵襲性增強(qiáng),轉(zhuǎn)分化增多,隨后轉(zhuǎn)分化后的上皮細(xì)胞通過受損斷裂的基底膜進(jìn)入間質(zhì)區(qū)，在腎間質(zhì)合成更多的ECM，再刺激MMP-9代償性增加……形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的迅速進(jìn)展。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在模型組術(shù)后3天的腎小管間質(zhì)區(qū)表達(dá)明顯增加，并隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)、腎間質(zhì)損害程度的加重而表達(dá)進(jìn)行性增加。TGF–β1是一種多效性的細(xì)胞因子，能夠促使ECM的過度增加和聚積，被認(rèn)為是器官纖維化過程中的核心介質(zhì)，是與纖維化發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的生長(zhǎng)因子，抑制其表達(dá)或生物活性可以延緩器官纖維化進(jìn)程[15]，故腎間質(zhì)中TGF–β1表達(dá)增加，可以認(rèn)為發(fā)生了腎間質(zhì)纖維化，F(xiàn)N、MMP-9均與TGF–β1表達(dá)呈顯著正相關(guān)，F(xiàn)N、MMP-9、TGF–β1的表達(dá)升高，提示FN、MMP-9均參與了腎間質(zhì)纖維化過程。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚不十分明確，單側(cè)輸尿管梗阻引起的腎梗阻是誘導(dǎo)腎纖維化最經(jīng)典的模型[16]，我們通過成功建立UUO模型，檢測(cè)到在腎間質(zhì)損害早期即出現(xiàn)FN、MMP-9蛋白表達(dá)的顯著增加，且均與TGF–β1表達(dá)、腎間質(zhì)損害程度呈正相關(guān)，r絕對(duì)值大于0.8，表明FN、MMP-9表達(dá)與TGF–β1、腎間質(zhì)纖維化相關(guān)密切，F(xiàn)N、MMP-9表達(dá)量的變化可作為我們判斷早期腎間質(zhì)損害程度的重要指標(biāo)，并為臨床早期干預(yù)腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。4參考文獻(xiàn)[1]RastaldiMP.Epithelial-mesenchymaltransitionanditsimplicationsforthedevelopmentofrenaltubulointerstitialfibrosis.JNePhrol.2006;19(4):407-412[2]OkonK.Tubulo-interstitialchangesinglomerulopathy.II.PrognosticSignificance.PolJPathol.2003;54(3):163-169.[3]陸海英,張悅，周娟,等.MMP-2和TIMP-2在腎間質(zhì)纖維化大鼠模型中的表達(dá)和意義[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2009,36(12):2328-2331.[4]AdolpheM,ParodiAL.Ethicalissuesinanimalexperimentation.BullAcadNatlMed.