第七章酶分子的化學修飾第七章酶分子的化學修飾1

酶作為生物催化劑，其高效性和專一性是其他催化劑所無法比擬的。因此，日益增多的酶制劑已用于食品發酵、疾病診治和預防、環境保護和監測、化工產品的生產，以及基因工程等生物技術領域。

但是酶在實際應用中有局限性：1、作為異體蛋白在體內難于吸收、易引起免疫反應和被識別降解；2、酶蛋白經不起溫度、酸堿、有機溶劑及時間的考驗，半衰期短、易變性失活；3、酶的活性、作用專一性和最適條件不一定能適應生產工藝要求，限制了酶制劑的應用范圍。

酶作為生物催化劑，其高效性和專一性是其他催化劑2改變酶特性有兩種主要的方法：1)通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。蛋白質水平2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達到改造酶的目的。核酸水平改變酶特性有兩種主要的方法：3化學修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修飾條件，在保持酶活性的基礎上，能夠在較大范圍內改變酶的性質，創造天然酶所不具備的優良特性，甚至創造出新的活性。

化學修飾方法雖多，但基本都是利用修飾劑所具有的各種化學基團特性，或直接或經過一定的活化過程，與酶分子上某氨基酸殘基（一般盡量選酶活性非必需基團）產生化學反應，對酶分子結構進行改造。第一節酶的化學修飾

（一級結構水平的改造）

（原理、方法、應用）

化學修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修4

一、化學修飾原理凡通過化學基團的引入或除去而使酶蛋白共價結構發生改變（側鏈基團的取代、肽鏈的限制性水解、分子內或分子間的交聯），都可稱為蛋白質的化學修飾。達到：改造酶的作用特性（包括改變酶活性、專一性、對效應物響應性能及對輔助因子的要求）提高酶的穩定性擴大在體內應用可能性（防止在體內非專一性水解、減少和消除免疫原性以利于醫療應用）一、化學修飾原理凡通過化學基團的引入或5化學修飾效果舉例用纖維蛋白的專一性單克隆抗體修飾尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。用乙醛酸修飾胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成親水性的α－NHCH2COOH后，該酶對60°C熱處理的穩定性增高了1000倍。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、L－谷氨酰胺酶、L－天門冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修飾后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，減慢了它們在動物血液循環中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。化學修飾效果舉例用纖維蛋白的專一性單克隆抗體修飾尿激酶，使其61、如何增強酶天然構象的穩定性與耐熱性

修飾劑分子存在多個反應基團，可與酶形成多點交聯。使酶的天然構象產生“剛性”結構。2、如何保護酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結合后，產生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。1、如何增強酶天然構象的穩定性與耐熱性73、如何維持酶功能結構的完整性與抗蛋白水解酶酶化學修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：1.大分子修飾劑產生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子。“遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2.酶分子上許多敏感基團交聯上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。3、如何維持酶功能結構的完整性與抗蛋白水解酶84、如何消除酶的抗原性及穩定酶的微環境1.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結合2.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環境的極性變化，維持酶活性部位微環境相對穩定。4、如何消除酶的抗原性及穩定酶的微環境95、改變酶學性質絕大多數酶經過修飾后，最大反應速度沒改變，但有些酶修飾后米氏常數會增大。原因可能是交聯于酶上的大分子修飾劑產生的空間障礙影響了底物對酶的接近和結合，但同時由于修飾酶穩定性增強和半衰期延長，可彌補Km值增大的缺陷。5、改變酶學性質10二、化學修飾分類（一）金屬離子置換修飾（二）大分子結合修飾（三）肽鏈有限水解修飾（四）酶蛋白側鏈基團修飾（五）親和修飾（六）氨基酸置換修飾二、化學修飾分類（一）金屬離子置換修飾11（一）金屬離子置換修飾1、概念2、作用范圍3、常用金屬離子4、方法步驟（一）金屬離子置換修飾1、概念121、概念通過改變酶分子中所含金屬離子，使酶的特性和功能發生改變的方法。1、概念通過改變酶分子中所含金屬離子，使酶的特性和功能發生改132、作用范圍含有金屬離子的酶金屬酶特點：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會失活，重新加入原離子則酶復活。（2）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現不同特性。2、作用范圍含有金屬離子的酶143、常用金屬離子（往往是二價離子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。3、常用金屬離子154、方法步驟向酶液加入一定量的EDTA－將酶與金屬鰲合物分離－金屬離子置換。4、方法步驟16５、舉例淀粉酶：一般的α-淀粉酶是多離子型的，含Ca2+、Mg2+、Zn2+等若把其它的離子都換為鈣離子，活力及穩定性均提高。所以淀粉酶的生產、保存和應用中可添加一定量的鈣離子。將鋅型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置換成鈣型蛋白酶，則酶活力可提高20-30%。若將鈣型蛋白酶制成結晶，則其酶活力比鋅型蛋白酶結晶的酶活力提高2-3倍。５、舉例17（二）大分子結合修飾1、概念2、通常使用的水溶性大分子修飾劑3、修飾方法4、大分子修飾后酶性質的變化（二）大分子結合修飾1、概念181、概念：利用水溶性大分子與酶結合，使酶的空間結構發生精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。1、概念：利用水溶性大分子與酶結合，使酶的空間結構發生精細的192、通常使用的水溶性大分子修飾劑聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價結合。2、通常使用的水溶性大分子修飾劑20聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產生交聯，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶半衰期相對穩定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內無毒性213、修飾方法修飾劑活化－與酶分子結合－對酶分子進行修飾3、修飾方法修飾劑活化－與酶分子結合－對酶分子進行修飾224、大分子修飾后酶性質的變化（1）提高酶活力（2）增加酶的穩定性半衰期：酶活力降低原來活力一半所經過的時間。（2）降低抗原抗體反應1.抗原2.抗體免疫抗原性抗原性反應抗原性4、大分子修飾后酶性質的變化（1）提高酶活力23例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結合，酶活力達到原有酶活力的5.1倍5.實例例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗24（三）肽鏈有限水解修飾1、概念2、修飾后酶性質的變化3、修飾劑（三）肽鏈有限水解修飾1、概念251、概念利用肽鏈有限水解，使酶的空間結構發生精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。1、概念26酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現以下三種情況中的一種：1

引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2仍維持活性中心的完整構象，保持酶活力。3有利于活性中心與底物結合并形成準確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進行，稱肽鏈有限水解。酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現以下三種情況中的一種：272、修飾后酶性質的變化（1）提高酶活力（2）降低或消除抗原性2、修飾后酶性質的變化283、修飾劑專一性較強的蛋白酶或肽酶3、修飾劑294.實例酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活

4.實例酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶307酶分子的化學修飾課件31b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活327酶分子的化學修飾課件33（四）酶分子的側鏈基團修飾1.定義采用一定的方法（一般為化學法）使酶蛋白的側鏈基團發生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法。（四）酶分子的側鏈基團修飾1.定義34可以用于研究各種基團在酶分子中的作用及其對酶的結構、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團時經常采用。酶蛋白的側鏈基團是指組成蛋白質的氨基酸殘基上的功能團。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結構的形成和穩定有重要作用。側鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構象的改變，從而改變酶的特性和功能。可以用于研究各種基團在酶分子中的作用及其對酶的結構、特性和功35（1）羧基修飾劑可與酶蛋白側鏈上的羧基發生反應的小分子化合物稱為羧基修飾劑。修飾劑:碳化二亞胺、甲醇-HCL、乙醇-HCL含有羧基的氨基酸：天門冬氨酸、谷氨酸等（1）羧基修飾劑可與酶蛋白側鏈上的羧基發生反應的小分子化合物36常見基團的化學修飾反應（酰胺化）：羧基見292頁常見基團的化學修飾反應（酰胺化）：羧基見292頁37（2）氨基修飾劑凡能使酶蛋白側鏈上的氨基發生改變的化合物稱為氨基修飾劑。修飾劑:乙酸酐、二硝基氟苯、碘代乙酸等。含有氨基的氨基酸：賴氨酸等（2）氨基修飾劑凡能使酶蛋白側鏈上的氨基發生改變的化合物稱為38常見基團的化學修飾反應（甲基化與乙酰化）：氨基常見基團的化學修飾反應（甲基化與乙酰化）：氨基39（3）巰基修飾劑兩個巰基可以形成二硫鍵穩定蛋白質結構，由于巰基具有很強的親核性，巰基一般是蛋白質分子中最容易反應的側鏈基團。修飾劑：二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽等（3）巰基修飾劑兩個巰基可以形成二硫鍵穩定蛋白質結構，由于巰40常見基團的化學修飾反應（烷基化）：巰基常見基團的化學修飾反應（烷基化）：巰基41（4）酚羥基修飾劑蛋白質的酪氨酸殘基上含有酚羥基。修飾方法：碘化法、硝化法等修飾劑：N-乙酰咪唑、碘、四硝基甲烷等。（4）酚羥基修飾劑蛋白質的酪氨酸殘基上含有酚羥基。42常見基團的化學修飾反應：酚羥基常見基團的化學修飾反應：酚羥基43（5）胍基修飾劑精氨酸殘基含有一個強堿性的胍基，很難被修飾，而一些二羰基化合物能夠在中性或弱堿性條件下與精氨酸反應，目前關于精氨酸的修飾的研究主要集中在二羰基化合物上。（5）胍基修飾劑精氨酸殘基含有一個強堿性的胍基，很難被修飾，44常見基團的化學修飾反應：胍基常見基團的化學修飾反應：胍基45指修飾劑與底物相類似的結構，對酶活性部位具有特異的親和性，只對活性部位的氨基酸殘基進行共價修飾的方法，也稱位點專一性修飾。作用原理與專一性不可逆抑制劑相同。

(五)親和修飾指修飾劑與底物相類似的結構，對酶活性部位具有特異的親和性，只46(六)氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，引起酶蛋白空間構象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。

通過兩個途徑實現：化學修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類少。蛋白質工程：定點突變技術。(六)氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸47例如，Bender等成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質和多肽的水解能力，卻出現了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進行修飾，操作復雜，難以工業化生產。

例如，Bender等成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性48定點突變技術（sitedirectedmutagenesis）是20世紀80年代發展起來的一種基因操作技術。是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術。定點突變技術為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進、可靠、行之有效的手段。定點突變技術（sitedirectedmutagenes49酶分子的定點突變1、基因序列分析2、蛋白質結構分析3、酶活性中心分析4、引物設計進行基因定點突變5、酶基因克隆表達6、變異特性分析酶分子的定點突變1、基因序列分析50三、酶化學修飾的應用

在醫藥方面：化學修飾可以提高醫用酶的穩定性，延長它在體內半衰期，抑制免疫球蛋白的產生，降低免疫原性和抗原性。

在生物技術領域：化學修飾酶能夠提高酶對熱，酸，堿和有機溶劑的耐性，改變酶的底物專一性和最適pH等酶學性質。

在酶結構功能研究中：1.研究酶空間結構與功能的關系，如酶的活性中心研究；2.確定氨基酸殘基的功能；3.測定酶分子中某種氨基酸的數量。三、酶化學修飾的應用在醫藥方面：化學修飾可以提高醫用51四、酶蛋白化學修飾的局限性1.擴散速度受限2.生物活性降低3.修飾劑呈現多種聚合度、選擇性不夠高，修飾后的酶分子相對分子質量分布寬、穩定性不夠理想等四、酶蛋白化學修飾的局限性1.擴散速度受限52第二節酶修飾后的性質變化熱穩定性：一般來說，熱穩定性有較大的提高。抗原性：比較公認的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩定性。第二節酶修飾后的性質變化熱穩定性：一般來說，熱穩定性有較大53半衰期：一般在體內的半衰期得到有效延長。由于酶分子經修飾后，增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩定性，從而延長了在體內的半衰期。最適pH：大部分酶經化學修飾后，酶的最適pH發生了變化，這種變化在應用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環境，在臨床應用上有較大意義。Km的變化：大多數酶經修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經修飾后，Km值變大。半衰期：一般在體內的半衰期得到有效延長。由于酶分子經修飾后，54表6-1天然酶和修飾酶的熱穩定性比較

酶

修飾劑

修飾酶

天然酶

處理條件(℃/時間)

殘留酶活(%)酰苷脫氫酶

胰蛋白酶

過氧化氫酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

人血清白蛋白

肝素

37/100min

100/30min

50/10min

100/30min

37/48h

37/24h

70

100

46

64

40

90

20

99

80

0

95

50表6-1天然酶和修飾酶的熱穩定性比較酶修飾劑修飾酶55酶L-Asn酶SOD酶

Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脫氫酶Arg酶過氧化氫酶胰蛋白酶抗原性修飾劑-葡萄糖苷酶核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-Ala消除消除消除消除消除消除消除降低降低消除表6-2修飾酶的抗原性變化酶L-Asn酶SOD酶Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脫氫酶56表6-3天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較酶抗抑制劑抗蛋白酶修飾劑抗失活劑過氧化氫酶核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶-葡萄糖苷酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白右旋糖苷抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗SDS抗大豆抑制劑抗胃蛋白酶抗胎盤抑制劑——抗尿素抗SDS表6-3天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較酶抗抑制劑抗蛋白酶57表6-4天然酶與修飾酶的半衰期比較酶羧肽酶Arg酶Gln-Asn酶尿酸酶超氧化物岐化酶過氧化氫酶修飾劑半衰期天然酶修飾酶白蛋白白蛋白糖肽右旋糖苷右旋糖苷PEG3.5h17h1.4h1h4h6min6h12h8h20h4h8h表6-4天然酶與修飾酶的半衰期比較酶羧肽酶Arg酶Gln58表6-5天然酶與修飾酶的最適pH酶修飾酶天然酶修飾劑糜蛋白酶豬肝尿酸酶吲哚-3-鏈烷羥化酶豬肝尿酸酶產沅假絲酵母尿酸酶白蛋白PEGPEG聚丙烯酸肝素10.57.4-8.55.0-5.59.08.83.58.28.28.09.0表6-5天然酶與修飾酶的最適pH酶修飾酶天然酶修飾劑糜蛋白59第三節變性、誘導與構象重建

（對酶高級結構調整）

酶肽鏈變性松散后，使其在有底物類似物或抑制劑存在的非天然條件下復性，酶將折疊成所需要的特殊結構，產生新的性狀，此即變性誘導構象重建的原理第三節變性、誘導與構象重建

（對酶高60酶分子的物理修飾通過物理修飾，可以了解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點在于不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發生某些變化和重排。酶分子的物理修飾通過物理修飾，可以了解不同物理條件下，特別是61再見！再見！62第七章酶分子的化學修飾第七章酶分子的化學修飾63

酶作為生物催化劑，其高效性和專一性是其他催化劑所無法比擬的。因此，日益增多的酶制劑已用于食品發酵、疾病診治和預防、環境保護和監測、化工產品的生產，以及基因工程等生物技術領域。

但是酶在實際應用中有局限性：1、作為異體蛋白在體內難于吸收、易引起免疫反應和被識別降解；2、酶蛋白經不起溫度、酸堿、有機溶劑及時間的考驗，半衰期短、易變性失活；3、酶的活性、作用專一性和最適條件不一定能適應生產工藝要求，限制了酶制劑的應用范圍。

酶作為生物催化劑，其高效性和專一性是其他催化劑64改變酶特性有兩種主要的方法：1)通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。蛋白質水平2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達到改造酶的目的。核酸水平改變酶特性有兩種主要的方法：65化學修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修飾條件，在保持酶活性的基礎上，能夠在較大范圍內改變酶的性質，創造天然酶所不具備的優良特性，甚至創造出新的活性。

化學修飾方法雖多，但基本都是利用修飾劑所具有的各種化學基團特性，或直接或經過一定的活化過程，與酶分子上某氨基酸殘基（一般盡量選酶活性非必需基團）產生化學反應，對酶分子結構進行改造。第一節酶的化學修飾

（一級結構水平的改造）

（原理、方法、應用）

化學修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修66

一、化學修飾原理凡通過化學基團的引入或除去而使酶蛋白共價結構發生改變（側鏈基團的取代、肽鏈的限制性水解、分子內或分子間的交聯），都可稱為蛋白質的化學修飾。達到：改造酶的作用特性（包括改變酶活性、專一性、對效應物響應性能及對輔助因子的要求）提高酶的穩定性擴大在體內應用可能性（防止在體內非專一性水解、減少和消除免疫原性以利于醫療應用）一、化學修飾原理凡通過化學基團的引入或67化學修飾效果舉例用纖維蛋白的專一性單克隆抗體修飾尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。用乙醛酸修飾胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成親水性的α－NHCH2COOH后，該酶對60°C熱處理的穩定性增高了1000倍。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、L－谷氨酰胺酶、L－天門冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修飾后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，減慢了它們在動物血液循環中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。化學修飾效果舉例用纖維蛋白的專一性單克隆抗體修飾尿激酶，使其681、如何增強酶天然構象的穩定性與耐熱性

修飾劑分子存在多個反應基團，可與酶形成多點交聯。使酶的天然構象產生“剛性”結構。2、如何保護酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結合后，產生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。1、如何增強酶天然構象的穩定性與耐熱性693、如何維持酶功能結構的完整性與抗蛋白水解酶酶化學修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：1.大分子修飾劑產生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子。“遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2.酶分子上許多敏感基團交聯上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。3、如何維持酶功能結構的完整性與抗蛋白水解酶704、如何消除酶的抗原性及穩定酶的微環境1.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結合2.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環境的極性變化，維持酶活性部位微環境相對穩定。4、如何消除酶的抗原性及穩定酶的微環境715、改變酶學性質絕大多數酶經過修飾后，最大反應速度沒改變，但有些酶修飾后米氏常數會增大。原因可能是交聯于酶上的大分子修飾劑產生的空間障礙影響了底物對酶的接近和結合，但同時由于修飾酶穩定性增強和半衰期延長，可彌補Km值增大的缺陷。5、改變酶學性質72二、化學修飾分類（一）金屬離子置換修飾（二）大分子結合修飾（三）肽鏈有限水解修飾（四）酶蛋白側鏈基團修飾（五）親和修飾（六）氨基酸置換修飾二、化學修飾分類（一）金屬離子置換修飾73（一）金屬離子置換修飾1、概念2、作用范圍3、常用金屬離子4、方法步驟（一）金屬離子置換修飾1、概念741、概念通過改變酶分子中所含金屬離子，使酶的特性和功能發生改變的方法。1、概念通過改變酶分子中所含金屬離子，使酶的特性和功能發生改752、作用范圍含有金屬離子的酶金屬酶特點：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會失活，重新加入原離子則酶復活。（2）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現不同特性。2、作用范圍含有金屬離子的酶763、常用金屬離子（往往是二價離子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。3、常用金屬離子774、方法步驟向酶液加入一定量的EDTA－將酶與金屬鰲合物分離－金屬離子置換。4、方法步驟78５、舉例淀粉酶：一般的α-淀粉酶是多離子型的，含Ca2+、Mg2+、Zn2+等若把其它的離子都換為鈣離子，活力及穩定性均提高。所以淀粉酶的生產、保存和應用中可添加一定量的鈣離子。將鋅型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置換成鈣型蛋白酶，則酶活力可提高20-30%。若將鈣型蛋白酶制成結晶，則其酶活力比鋅型蛋白酶結晶的酶活力提高2-3倍。５、舉例79（二）大分子結合修飾1、概念2、通常使用的水溶性大分子修飾劑3、修飾方法4、大分子修飾后酶性質的變化（二）大分子結合修飾1、概念801、概念：利用水溶性大分子與酶結合，使酶的空間結構發生精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。1、概念：利用水溶性大分子與酶結合，使酶的空間結構發生精細的812、通常使用的水溶性大分子修飾劑聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價結合。2、通常使用的水溶性大分子修飾劑82聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產生交聯，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶半衰期相對穩定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內無毒性833、修飾方法修飾劑活化－與酶分子結合－對酶分子進行修飾3、修飾方法修飾劑活化－與酶分子結合－對酶分子進行修飾844、大分子修飾后酶性質的變化（1）提高酶活力（2）增加酶的穩定性半衰期：酶活力降低原來活力一半所經過的時間。（2）降低抗原抗體反應1.抗原2.抗體免疫抗原性抗原性反應抗原性4、大分子修飾后酶性質的變化（1）提高酶活力85例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結合，酶活力達到原有酶活力的5.1倍5.實例例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗86（三）肽鏈有限水解修飾1、概念2、修飾后酶性質的變化3、修飾劑（三）肽鏈有限水解修飾1、概念871、概念利用肽鏈有限水解，使酶的空間結構發生精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。1、概念88酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現以下三種情況中的一種：1

引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2仍維持活性中心的完整構象，保持酶活力。3有利于活性中心與底物結合并形成準確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進行，稱肽鏈有限水解。酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現以下三種情況中的一種：892、修飾后酶性質的變化（1）提高酶活力（2）降低或消除抗原性2、修飾后酶性質的變化903、修飾劑專一性較強的蛋白酶或肽酶3、修飾劑914.實例酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活

4.實例酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶927酶分子的化學修飾課件93b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活947酶分子的化學修飾課件95（四）酶分子的側鏈基團修飾1.定義采用一定的方法（一般為化學法）使酶蛋白的側鏈基團發生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法。（四）酶分子的側鏈基團修飾1.定義96可以用于研究各種基團在酶分子中的作用及其對酶的結構、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團時經常采用。酶蛋白的側鏈基團是指組成蛋白質的氨基酸殘基上的功能團。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結構的形成和穩定有重要作用。側鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構象的改變，從而改變酶的特性和功能。可以用于研究各種基團在酶分子中的作用及其對酶的結構、特性和功97（1）羧基修飾劑可與酶蛋白側鏈上的羧基發生反應的小分子化合物稱為羧基修飾劑。修飾劑:碳化二亞胺、甲醇-HCL、乙醇-HCL含有羧基的氨基酸：天門冬氨酸、谷氨酸等（1）羧基修飾劑可與酶蛋白側鏈上的羧基發生反應的小分子化合物98常見基團的化學修飾反應（酰胺化）：羧基見292頁常見基團的化學修飾反應（酰胺化）：羧基見292頁99（2）氨基修飾劑凡能使酶蛋白側鏈上的氨基發生改變的化合物稱為氨基修飾劑。修飾劑:乙酸酐、二硝基氟苯、碘代乙酸等。含有氨基的氨基酸：賴氨酸等（2）氨基修飾劑凡能使酶蛋白側鏈上的氨基發生改變的化合物稱為100常見基團的化學修飾反應（甲基化與乙酰化）：氨基常見基團的化學修飾反應（甲基化與乙酰化）：氨基101（3）巰基修飾劑兩個巰基可以形成二硫鍵穩定蛋白質結構，由于巰基具有很強的親核性，巰基一般是蛋白質分子中最容易反應的側鏈基團。修飾劑：二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽等（3）巰基修飾劑兩個巰基可以形成二硫鍵穩定蛋白質結構，由于巰102常見基團的化學修飾反應（烷基化）：巰基常見基團的化學修飾反應（烷基化）：巰基103（4）酚羥基修飾劑蛋白質的酪氨酸殘基上含有酚羥基。修飾方法：碘化法、硝化法等修飾劑：N-乙酰咪唑、碘、四硝基甲烷等。（4）酚羥基修飾劑蛋白質的酪氨酸殘基上含有酚羥基。104常見基團的化學修飾反應：酚羥基常見基團的化學修飾反應：酚羥基105（5）胍基修飾劑精氨酸殘基含有一個強堿性的胍基，很難被修飾，而一些二羰基化合物能夠在中性或弱堿性條件下與精氨酸反應，目前關于精氨酸的修飾的研究主要集中在二羰基化合物上。（5）胍基修飾劑精氨酸殘基含有一個強堿性的胍基，很難被修飾，106常見基團的化學修飾反應：胍基常見基團的化學修飾反應：胍基107指修飾劑與底物相類似的結構，對酶活性部位具有特異的親和性，只對活性部位的氨基酸殘基進行共價修飾的方法，也稱位點專一性修飾。作用原理與專一性不可逆抑制劑相同。

(五)親和修飾指修飾劑與底物相類似的結構，對酶活性部位具有特異的親和性，只108(六)氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，引起酶蛋白空間構象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。

通過兩個途徑實現：化學修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類少。蛋白質工程：定點突變技術。(六)氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸109例如，Bender等成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質和多肽的水解能力，卻出現了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進行修飾，操作復雜，難以工業化生產。

例如，Bender等成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性110定點突變技術（sitedirectedmutagenesis）是20世紀80年代發展起來的一種基因操作技術。是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術。定點突變技術為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進、可靠、行之有效的手段。定點突變技術（sitedirectedmutagenes111酶分子的定點突變1、基因序列分析2、蛋白質結構分析3、酶活性中心分析4、引物設計進行基因定點突變5、酶基因克隆表達6、變異特性分析酶分子的定點突變1、基因序列分析112三、酶化學修飾的應用

在醫藥方面：化學修飾可以提高醫用酶的穩定性，延長它在體內半衰期，抑制免疫球蛋白的產生，降低免疫原性和抗原性。

在生物技術領域：化學修飾酶能夠提高酶對熱，酸，堿和有機溶劑的耐性，改變酶的底物專一性和最適pH等酶學性質。

在酶結構功能研究中：1.研究酶空間結構與功能的關系，如酶的活性中心研究；2.確定氨基酸殘基的功能；3.測定酶分子中某種氨基酸的數量。三、酶化學修飾的應用在醫藥方面：化學修飾可以提高醫用113四、酶蛋白化學修飾的局限性1.擴散速度受限2.生物活性降低3.修飾劑呈現多種聚合度、選擇性不夠高，修飾后的酶分子相對分子質量分布寬、穩定性不夠理想等四、酶蛋白化學修飾的局限性1.擴散速度受限114第二節酶修飾后的性質變化熱穩定性：一般來說，熱穩定性有較大的提高。抗原性：比較公認的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩定性。第二節酶修飾后的性質變化熱穩定性：一般來說，熱穩定性有較大115半衰期：一般在體內的半衰期得到有效延長。由于酶分子經修飾后，增強對熱、蛋白酶、