基因工程(jīyīngōngchéng)制藥工藝第一頁，共22頁。第六章基因工程(jīyīngōngchéng)制藥工藝6.1基因工程制藥微生物表達系統6.2基因工程大腸桿菌的構建(ɡòujiàn)6.3基因工程菌的發酵培養與控制第二頁，共22頁。6.3基因工程(jīyīngōngchéng)菌發酵培養與控制6.3.1培養基組成與控制6.3.2培養工藝與控制6.3.3產物(chǎnwù)誘導表達與終點控制第三頁，共22頁。6.3.1培養基組成(zǔchénɡ)與控制營養與環境作用：碳源、氮源、無機鹽和生長因子工藝(gōngyì)作用：消泡劑篩選與表達：選擇劑，誘導物第四頁，共22頁。1、碳源大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)：蛋白胨等蛋白質的降解物作為碳源。酵母：利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質。添加低濃度的單糖和雙糖及其他有機物如甘油等對菌體生長具有一定的促進作用。濃度稍高后就表現出底物抑制作用。葡萄糖優先利用會造成培養基的酸化。第五頁，共22頁。2、氮源直接很好地吸收利用銨鹽等，一般(yībān)不能利用硝態氮。幾乎都能利用有機氮源。不同工程菌對氮源利用能力差別很大，具有很高的選擇性。大腸桿菌：利用大分子有機氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸為氮源。第六頁，共22頁。3、無機鹽磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量(dàliàng)元素和鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子形態。基因工程菌生長提供必需的礦物質。第七頁，共22頁。4、選擇(xuǎnzé)劑維持工程菌的純正性和質粒的穩定性的化合物。兩類：營養缺陷互補標記和抗生素抗性選擇標記發酵培養過程中質粒易丟失，使之成為宿主菌。為了保證(bǎozhèng)質粒的穩定性，不丟失，根據質粒的標記基因，添加或缺陷選擇劑。第八頁，共22頁。基因工程大腸桿菌含有抗生素抗性基因，抗生素作為選擇(xuǎnzé)劑：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等。基因工程酵母菌常用氨基酸營養缺陷型，缺陷亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸等。第九頁，共22頁。5、誘導(yòudǎo)物誘導表達型工程菌：在細胞生長到一定階段，必需添加誘導物，以解除目標(mùbiāo)基因的抑制狀態，活化基因，進行轉錄和翻譯，生成產物。誘導物成為產物表達必不可少的。lac啟動子表達系統：IPTG誘導。甲醇營養型酵母：加入甲醇進行誘導。第十頁，共22頁。6.3.2培養(péiyǎng)工藝與控制溫度(wēndù)溶解氧pH第十一頁，共22頁。誘導表達型工程菌：在細胞生長到一定階段，必需添加誘導物，以解除目標(mùbiāo)基因的抑制狀態，活化基因，進行轉錄和翻譯，生成產物。基因工程大腸桿菌含有抗生素抗性基因，抗生素作為選擇(xuǎnzé)劑：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等。細菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.3產物(chǎnwù)誘導表達與終點控制甲醇營養型酵母：加入甲醇進行誘導。釀酒酵母生長最適溫度30℃，最高溫度40℃。與信號肽序列融合，組成性分泌表達整合到染色體中，嚴謹控制，分泌表達分階段控制pH：根據試驗結果來確定(quèdìng)生長最適pH和產物最適pH，以達到最佳生產。一般情況下，目標產物(chǎnwù)對宿主是不利的不同工程菌對氮源利用能力差別很大，具有很高的選擇性。甲醇營養型酵母：加入甲醇進行誘導。2培養(péiyǎng)工藝與控制干擾素是在酸性條件下穩定，而在堿性條件下容易降解。基因工程大腸桿菌含有抗生素抗性基因，抗生素作為選擇(xuǎnzé)劑：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等。2、溫度(wēndù)誘導表達1、溫度(wēndù)對工程菌生長的影響符合(fúhé)三基點原則：最低，最適，最高。大腸桿菌和釀酒酵母生長最低溫度10℃。大腸桿菌生長最適溫度37℃，最高溫度45℃。釀酒酵母生長最適溫度30℃，最高溫度40℃。第十二頁，共22頁。誘導時間：菌體生長的對數(duìshù)期或稍后一些，升高溫度，合成產物。了解發酵過程中各個階段的適宜pH以后，進一步設法控制pH在合適的范圍內。3產物(chǎnwù)誘導表達與終點控制與信號肽序列融合，組成性分泌表達大腸桿菌：利用大分子有機氮源，酵母粉等。生長期維持(wéichí)37℃，生產期提高溫度42℃。當產率最大時，結束發酵。細菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.酵母：利用氨基酸為氮源。細菌(xìjūn)：IPTG誘導高度嚴謹控制無毒蛋白的高水平表達生長與生產溫度不一致。較高溫度表達量大，易形成包涵體。策略：較低溫(dīwēn)度下有利于表達可溶性蛋白質。對于熱敏感的蛋白質，高溫會降解破壞。策略：生產期可采用先高溫，然后低溫(dīwēn)，變溫表達，避免蛋白質降解。第十三頁，共22頁。兩端變溫發酵培養：前期：較高溫度發酵，獲得足夠高的菌體密度。后期：較低溫度發酵，對菌體合成目標產物的抑制不明顯，但可有效抑制目標產物的降解和包涵體形成，總體提高工程菌的生產能力。溫度誘導型大腸桿菌表達系統：生長期維持(wéichí)37℃，生產期提高溫度42℃。第十四頁，共22頁。2、pH值對發酵(fājiào)的影響細菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.5-7.5真菌喜歡微酸性：酵母適宜pH為5.0-6.0pH值影響產物穩定性，最適生長和最適生產pH不同。干擾素是在酸性條件下穩定，而在堿性條件下容易降解。酸性環境有利于發揮菌株生產能力。乙酸的產生(chǎnshēng)使菌體生長速率下降，也抑制基因表達。第十五頁，共22頁。了解發酵過程中各個階段的適宜pH以后，進一步設法控制pH在合適的范圍內。分階段控制pH：根據試驗結果來確定(quèdìng)生長最適pH和產物最適pH，以達到最佳生產。第十六頁，共22頁。3、溶解氧工程菌是好氧微生物，生長過程需要大量氧。無氧呼吸會導致大量的能量消耗，同時產生有機酸，對細胞生長極為不利，甚至有毒害。從供應量和需要量（菌體生長、質粒穩定性、產物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設備的供氧能力，在臨界溶解氧濃度(nóngdù)之上。調節攪拌轉速和通氣量。第十七頁，共22頁。6.3.3產物誘導(yòudǎo)與終點控制一般情況下，目標產物(chǎnwù)對宿主是不利的常用策略：誘導表達根據啟動子類型和目標產物(chǎnwù)表達的調控模式而定當產率最大時，結束發酵。第十八頁，共22頁。在生產(shēngchǎn)中應嚴格控制適宜的誘導時間：非常重要誘導物的濃度及其發酵(fājiào)溫度，影響表達量，產物存在形式。第十九頁，共22頁。工程菌啟動子表達特點誘導條件大腸桿菌lac高度嚴謹控制蛋白的轉錄與表達IPTG大腸桿菌T7高度嚴謹控制無毒蛋白的高水平表達IPTG大腸桿菌PL、PR高度嚴謹轉錄控制有毒蛋白的表達高溫（42℃）大腸桿菌phoA與信號肽序列融合，組成性分泌表達無需誘導釀酒酵母GAL高拷貝附加質粒，嚴謹控制，分泌系統半乳糖畢赤酵母AOX1整合到染色體中，嚴謹控制，分泌表達甲醇畢赤酵母GAP組成性分泌表達無需誘導第二十頁，共22頁。1、化學誘導(yòudǎo)表達