第一節概述

天然生物材料制備生化藥物的過程大體為：①原料的選樣和預處理；②原料的粉碎；③提取，即從原料中經溶劑分離有效成分，制成粗品的工藝過程；④純化，即粗制品經鹽析、有機溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結晶等步驟進行精制的工藝過程；⑤干燥(gānzào)及保存；⑥制劑，即原料藥經精細加工制成片劑、針劑、凍干劑等供臨床應用的各種劑型。2022/11/131第一頁，共四十六頁。第二節原料(yuánliào)選擇和預處理原料選擇的基本原則①要選擇有效成分含量高的新鮮材料(cáiliào)；②來源豐富易得；③制造工藝簡單易行；④成本比較低；⑤經濟效果要好。

2022/11/132第二頁，共四十六頁。第三節原料(yuánliào)的粉碎

一、機械法粉碎少量原料時，可使用高速組織搗碎機(10000r／min)、勻漿器、研缽(yánbō)等。工業生產上一般常用的粉碎設備有電磨機、球磨機、萬能粉碎機，絞肉機、擊碎機等。二、物理法

1．反復凍融法；2．冷熱交替法；

3．超聲波處理法；4．加壓破碎法。2022/11/133第三頁，共四十六頁。第三節原料(yuánliào)的粉碎三、生化(shēnɡhuà)和化學方法

1．自溶法

2．溶菌酶處理法

3.表面活性劑處理法

2022/11/134第四頁，共四十六頁。第四節提取

分固-液、液-液提取提取條件的選擇：溶劑(róngjì)、PH值、溫度影響提取的因素：被提取物質溶解度的大小、擴散作用的影響、分配作用的影響超臨界流體萃取：2022/11/135第五頁，共四十六頁。第五節分離純化

主要應用的方法有鹽析法、有機溶劑沉淀法、pI沉淀法、膜分離法、層析法、凝膠過濾法、離子交換法等。一、鹽析法

1.鹽析及方法利用不同蛋白質在高濃度的鹽溶液中，溶解度不同程度的降低來進行分離純化的方法。有Ks法和β法。

2.特點對設備和條件要求低，安全，應用范圍廣泛。在高濃度鹽存在下，蛋白質不易發生變化，一般可在室溫下進行操作(cāozuò)。分辨率低，Ks法多用于提取液的前期分離工作。

2022/11/136第六頁，共四十六頁。第五節分離純化一、鹽析法

3.常用的中性鹽和加入方式常用中性鹽有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸納、氯化鈉、磷酸鈉等。硫酸銨的鹽析能力(nénglì)強，飽和溶液濃度大，溶解度受溫度影響小，一般不會使蛋白質變性，缺點是緩沖能力(nénglì)差，pH常在4．5—5．5之間。但價廉易得，分段分離效果也比其他鹽類好。加入方式：分步固體鹽或飽和溶液2022/11/137第七頁，共四十六頁。第五節分離純化一、鹽析法

4.鹽析時應注意的問題

(1)鹽飽和度的影響(yǐngxiǎng)；(2)pH的選擇；（3）蛋白質濃度的影響；（4）溫度的影響；（5）鹽析沉淀物的脫鹽；

2022/11/138第八頁，共四十六頁。第五節分離純化二、有機溶劑沉淀法利用不同蛋白質在不同濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱有機溶劑沉淀法。乙醇和丙酮是最常用的有機溶劑。有機溶劑沉淀法比鹽析法分辨力強，沉淀也好過濾，但對有些生物(shēngwù)活性物質能引起失活和變性。應用時還應注意防止溶劑揮發和火災等。

2022/11/139第九頁，共四十六頁。第五節分離純化有機溶劑沉淀時應注意的問題

1控制工藝(gōngyì)過程的溫度；

2防止溶劑局部濃度過高；

3及時處理沉淀物；

4pH值的選擇;5比鹽析法條件嚴格;2022/11/1310第十頁，共四十六頁。第五節分離純化三、等電點沉淀法等電點：

2022/11/1311第十一頁，共四十六頁。第五節分離純化三、等電點沉淀法利用蛋白質在等電點時溶解度最低，而各種(ɡèzhǒnɡ)蛋白質又具有不同的等電點的特性進行分離的工藝過程，稱等電點沉淀法。由于各種(ɡèzhǒnɡ)蛋白質在等電點時，仍有一定的溶解度而沉淀不完全，多數蛋白質的等電點又都十分接近，所以單獨使用效果不理想，分辨力差，多用于提取后除雜蛋白，實際生產中常與有機溶劑沉淀法、鹽析法聯合使用。2022/11/1312第十二頁，共四十六頁。第五節分離純化四、膜分離法膜分離技術包括超濾、反滲透析、電滲析、微孔過濾、氣體滲析和超精密過濾等，其中超濾、反滲透析、微孔過濾和超精密過濾在醫藥領域中的應用較為常見。1．超濾在液壓（氮氣或真空）驅動下，分離粒子的范圍，一般為0．001一0．01μm（溶劑(róngjì)和小分子透過），適用于酶和蛋白質類生化藥物的分離、濃縮、脫鹽、提純、除菌、除病毒和熱原等。2022/11/1313第十三頁，共四十六頁。第五節分離純化四、膜分離法

1．超濾2022/11/1314第十四頁，共四十六頁。第五節分離純化四、膜分離法

1．超濾參數：膜（纖維素硝酸酯或醋酸酯、芳香酰胺纖維等）；水的流速；相對分子質量的截止值(截留(jiéliú)分子量)。超濾設備：管式、多層板式、卷式和中空纖維型等。國外發展較快的是一種內壓式中空纖維型。2022/11/1315第十五頁，共四十六頁。第五節分離純化四、膜分離法

2.反滲透溶劑從溶液濃度高的一側傳遞到濃度低的一側，稱反滲透。分離介質：高分子透過性薄膜；設備：與超濾相仿應用(yìngyòng)：美國Millipore設計的反滲透裝置，已有100多套，生產符合美國藥典的純水或注射用水，還用于氨基酸、激素的濃縮等2022/11/1316第十六頁，共四十六頁。第五節分離純化四、膜分離法

3．微孔濾膜由高分子材料制成的薄膜過濾介質，可以過濾一般(yībān)介質不能截留的細菌和微粒。膜的微孔徑在0．2一l0μm之間。過濾器有板式和管式兩種。廣泛應用于濾除微粒和微生物，如濾除大輸液和水針劑中的污染微粒；還有熱敏性藥物的除菌，如胰島素、C0A、ATP、血清蛋白、丙種球蛋白、激素等。2022/11/1317第十七頁，共四十六頁。第五節分離純化四、膜分離法

4．超精密過濾以聚乙烯醇為主體的中空多孔濾膜，分級性能(xìngnéng)在超濾膜與微孔濾膜之間，為0．01—0．2μm。用于水的精制(脫除鐵質、菌和微粒)、循環水的凈化、除懸浮固體離子以及糖液、酶液的精制等。2022/11/1318第十八頁，共四十六頁。第五節分離純化五、離子交換法（離子交換層析）

1、基本原理

離子(lízǐ)交換樹脂：載體、功能團、平衡離子(lízǐ)載體：樹脂（苯乙烯型、丙烯酸型、酚醛型）、纖維素、葡聚糖凝膠。功能團：磺酸根、磷酸根、羧基；季胺鹽、伯仲叔胺基；CM、DEAE等。平衡離子：氫離子、鈉離子、氫氧根離子、2022/11/1319第十九頁，共四十六頁。第五節分離純化五、離子交換法（離子交換層析(cénɡxī)）

2、樹脂種類第一類強酸性陽離子交換樹脂；第二類弱酸性陽離子交換樹脂；第三類強堿性陰離子交換樹脂；第四類弱堿性陰離子交換樹脂；

2022/11/1320第二十頁，共四十六頁。第五節分離純化五、離子交換(lízǐjiāohuàn)法（離子交換(lízǐjiāohuàn)層析）

3、影響交換速度的因素2022/11/1321第二十一頁，共四十六頁。第五節分離純化五、離子交換法（離子交換層析）

3、影響交換速度(sùdù)的因素樹脂顆粒大小、攪拌和流速、離子濃度、離子的水合半徑、酸堿性的強弱和溶液pH值、交聯度的大小、有機溶劑、交換容量。2022/11/1322第二十二頁，共四十六頁。第五節分離純化五、離子交換法（離子交換層析）

4、離子交換操作方法（1）樹脂的選擇當目的物具有較強的堿性和酸性時，宜選用弱酸性和弱堿性的樹脂；氨基酸多用強酸樹脂；蛋白質、酶和其它生物大分子的分離(fēnlí)多采用弱堿或弱酸性樹脂，以減少生物大分子的變性，有利于洗脫，并提高選擇性。另外因素：孔徑、化學穩定性、機械性能等2022/11/1323第二十三頁，共四十六頁。第五節分離純化五、離子交換法（離子交換層析）

4、離子交換操作方法（2）樹脂的處理(chǔlǐ)和再生（3）基本操作方法操作方式：靜態和動態洗脫方式：靜態和動態；洗脫液分酸、堿、鹽、溶劑等。2022/11/1324第二十四頁，共四十六頁。第五節分離純化六、凝膠層析定義：指混合物隨流動相流經裝有凝膠作為固定相的層析柱時，因其各種物質分子大小不同而被分離的技術。又稱凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾等。也稱阻滯擴散層析、排阻層析等。特點：設備簡單，操作方便，分離效果好，回收率高，分離條件緩和，不致引起生物活性物質變性和失活，凝膠可重復使用．無需繁復(fánfù)的再生處理。缺點是分離速度較慢。廣泛應用于分離氨基酸、多肽、蛋白質、酶及多糖等生化物質。2022/11/1325第二十五頁，共四十六頁。第五節分離純化六、凝膠層析(cénɡxī)

1．基本原理2022/11/1326第二十六頁，共四十六頁。第五節分離純化六、凝膠層析

2．幾種常用凝膠葡聚糖凝膠（SephadexG）是一種非離子型的無定形或稱珠狀顆粒物質，化學性質比較穩定，不溶于水、弱酸、堿和鹽溶液。含有少量的羧基，故對陽離子有輕微的吸附作用。聚丙烯酰胺凝膠（生物凝膠—P）在pH2一11范圍內使用。它由碳—碳骨架構成，完全是惰性的，適宜作為凝膠層析的載體(zàitǐ)。缺點是不耐酸，遇酸時酰胺鍵會水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團。2022/11/1327第二十七頁，共四十六頁。第五節分離純化六、凝膠層析

2．幾種常用凝膠瓊脂糖凝膠（瑞典sepharose．美國稱Bio—Gel—A，英國稱Sagavac等。）是一種天然凝膠，不是共價交聯，是以氫鍵交聯的。不同孔隙程度是以改變瓊脂搪濃度而達到(dádào)的。化學穩定性不如葡聚糖凝膠。疏水性凝膠常用的為聚甲基丙烯酸酯(Polmethacrylate)凝膠或以二乙烯苯為交聯劑的聚苯乙烯凝膠(如Styroge1及Bio—Beads—S)。。2022/11/1328第二十八頁，共四十六頁。第五節分離純化六、凝膠層析(cénɡxī)

2．幾種常用凝膠2022/11/1329第二十九頁，共四十六頁。第五節分離純化六、凝膠層析

3.影響凝膠層析的因素

(1)凝膠的選擇（考慮凝膠特性以及分離目的和樣品的性質）；

(2)洗脫液流速（約在30—200m1/h）；

(3)離子強度(qiángdù)和pH值；

(4)分離液體積通常為凝膠床總體積的5％-10％；

(5)柱的長度和直徑（長徑之比通常為10：1或7：1）；（6）V0和Vi

（裝填良好的柱，V0和Vi的值的比率應為40%-60%）。2022/11/1330第三十頁，共四十六頁。第五節分離純化六、凝膠層析

4、凝膠層析的應用（1）脫鹽；（2）分子量測定；（3）去熱原和分離(fēnlí)純化；2022/11/1331第三十一頁，共四十六頁。第五節分離純化七、親合層析

1．基本原理定義：利用生物大分子的特異親和力而設計的層折技術。特點：從粗提液中，通過一次簡便處理．便可獲得高純度的活性物質，既可分離一些生物材料中含量極微的物質，又能分離一些性質十分相似的物質。具有設備(shèbèi)要求不高，操作簡便，適用范圍廣，特異性強，分離速度快，效果好，條件溫和等優點。但親合吸附劑的通用性較差，洗脫條件較苛刻。2022/11/1332第三十二頁，共四十六頁。第五節分離純化七、親合層析1．基本原理配基：可逆結合(jiéhé)的特異性物質。載體：與配基結合的層析介質。配體：2022/11/1333第三十三頁，共四十六頁。第五節分離純化七、親合層析

2．幾種常用載體（1）瓊脂糖凝膠

Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和U1trogelsA一2，A—4，A一6(LKB)。這類載體能使吸附物質保持活性，能迅速活化并接上各種功能基團，結構疏松孔徑(kǒngjìng)大，流速快，非專一性吸附少;SepharoseCL是用2，3—二溴丙烷處理的交聯瓊脂糖，它的穩定性明顯增加，能在pH3一14中應用，擴大了親和柱制備時化學反應選用的范圍，并能經受比較劇烈的洗脫條件。

2022/11/1334第三十四頁，共四十六頁。第五節分離純化七、親合層析

2．幾種常用載體其他的還有葡聚糖凝膠、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃珠等。

3.配基

特殊配基：底物、抑制劑、輔因子（酶）；抗原、病毒、細胞（抗體）；互補的堿基順序(shùnxù)、組蛋白、核酸聚合酶（核酸）。

通用配基：蛋白質A-SepharoseCL-4B（IgG及其系列）、ConA-Sepharose(α-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃甘露醇)等。2022/11/1335第三十五頁，共四十六頁。第五節分離純化七、親合層析

4．影響吸附劑親和力的幾個因素

(1)配基濃度(nóngdù)（配體濃度(nóngdù)）；

(2)空間障礙（特別是親合力低或分子量大而配基為小分子）；

(3)配基與載體的結合位點；

(4)載體孔徑；

(5)微環境；

5．洗脫條件2022/11/1336第三十六頁，共四十六頁。第六節濃縮

濃縮手段(shǒuduàn)：蒸發、沉淀蒸發濃縮裝置：薄膜蒸發濃縮、減壓蒸發濃縮、吸收濃縮（最常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、凝膠等）等。2022/11/1337第三十七頁，共四十六頁。第六節濃縮2022/11/1338第三十八頁，共四十六頁。第七節結晶

結晶一般生化藥物結晶的條件：純度、濃度、pH、溫度(wēndù)、時間以及晶種等。2022/11/1339第三十九頁，共四十六頁。第八節干燥

干燥干燥是從濕的固體生化藥物中除去水分或溶劑而獲得相對或絕對于燥制品的工藝過程。通常包括原料藥的干燥和制成的臨床制劑的干燥。最常用的方法：常壓干燥、減壓干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等，其干燥設備主要有：廂式干燥器、真空(zhēnkōng)干燥器、冷凍干燥器、管式氣流干燥器、沸騰干燥器、噴霧干燥器等等。2022/11/1340第四十頁，