第四節酶的人工模擬一、模擬酶的概念：人工模擬酶就是根據酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的蛋白或非蛋白質結構的化合物。模擬酶用合成高分子來模擬酶的結構、特性、作用原理以及酶在生物體內的化學反應，一般具有高效和高適應性的特點，在結構上比天然酶相對(xiāngduì)簡單。模擬酶不僅在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環境等結構特征，更重要的是它能摸擬酶的作用機制和立體化學等特性。第一頁，共五十一頁。二、模擬(mónǐ)酶的理論基礎1.模擬酶的酶學基礎Pauling穩定(wěndìng)過渡態理論：酶先與底物結合，進而選擇性地穩定(wěndìng)某一特定反應的過渡態（TS），降低反應活化能，從而加快反應速度。模擬酶要和酶一樣，能夠在結合底物過程中，通過底物的定向化、鍵的扭曲及變形來降低反應的活化能。第二頁，共五十一頁。第三頁，共五十一頁。第四頁，共五十一頁。2.主-客體化學和超分子化學主-客體化學的基本意義來源于酶和底物的相互作用，體現為主體(zhǔtǐ)和客體在結合部位的客間及電子排列的互補。超分子的形成源于底受和受體的結合，這種結合基于非共價鍵相互作用，超分子兼具分子識別、催化和選擇性輸出的功能。主-客體化學和超分子化學已經成為酶人工模擬的重要理論基礎，是人工模擬酶研究的重要理論武器。第五頁，共五十一頁。三、模擬(mónǐ)酶的分類根據Kirby分類法，模擬酶可分為：單純酶模型：以化學方法通過天然酶活性的模擬來重建和改造酶活性。機制酶模型：通過對酶作用機制諸如識別(shíbié)、結合和過渡態穩定化的認識，來指導酶模型的設計和生產。單純合成的酶樣化合物：一些化學合成的具有酶樣催化活性的簡單分子。第六頁，共五十一頁。按照模擬(mónǐ)酶的屬性，可分為：主-客體酶（環糊精、冠醚、穴醚、雜環大環化合物和卟啉類等）膠束酶肽酶半合成酶分子印跡酶第七頁，共五十一頁。1.主-客體(kètǐ)酶模型優良的模擬酶—環糊精（cyclodextrin，CD）。能提供一個疏水的結合部位并能與一些無機和有機分子形成包結絡合物，以此影響和催化一些反應。由幾個D-(+)-吡喃葡萄糖殘基通過α-1，4糖苷鍵連接而成。每個葡萄糖殘基呈現椅式構象，整個分子類似環柱形分子，由于環糊精分子空穴邊緣有許多羥基，能溶于水，空穴內基本是疏水的。環糊精催化的特點是：參與反應的底物分子先被環糊精分子包接，再于其發生反應，與酶促反應十分相似，已模擬了轉氨酶、核糖核酸酶、碳酸苷酶等。除了環糊精等天然存在(cúnzài)的宿主酶模型外，人們還合成了冠醚、穴醚、環番、環芳烴等大環多齒配體來構建酶模型。第八頁，共五十一頁。第九頁，共五十一頁。2.膠束模擬(mónǐ)酶膠束在水溶液中提供了疏水微環境，可以對底物束縛，如果再在膠束上共價或非共價結合了催化基團和一些輔酶后，就有可能提供“活性中心”部位(bùwèi)，使膠束成為具有酶活力或部分酶活力的膠束模擬酸。目前比較重要的膠束酶模型有：模擬水解酶的膠束酶模型輔酶的膠束酶模型金屬膠束酶模型第十頁，共五十一頁。3.肽酶肽酶就是模擬(mónǐ)天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。4.半合成酶以天然酶為母體，用化學方法或基因工程方法引進適當的活性部位或催化基團(jītuán)，從而形成一種新的人工酶。第十一頁，共五十一頁。5.印跡(yìnjì)酶分子印跡：制備對某一特定分子具有選擇性的聚合物的過程。該特定分子稱為印跡分子或模板。（1）分子印跡的原理分子印跡的過程：1、選定印跡分子和功能單位，讓它們(tāmen)之間發生互補作用，形成印跡分子功能單位復合物。2、用交聯劑在印跡分子功能單位復合物周圍發生聚合反應，形成交聯的聚合物。3、從聚合物中除去印跡分子，得到對印跡分子具有選擇性的聚合物。第十二頁，共五十一頁。第十三頁，共五十一頁。第十四頁，共五十一頁。（2）印跡(yìnjì)分子與單體相互作用的類型印跡方法：共價分子印跡和非共價分子印跡。非共價分子印跡：首先是印跡分子與功能單位相混合，二者以非共價鍵發生反應，然后功能單位與交聯劑發生共聚合，形成高交聯的剛性聚合物，最后使印跡分子從聚合物上脫離，并留下一個在形狀和功能基團位置上與印跡分子相互補的識別部位(bùwèi)。共價分子印跡：印跡分子與功能基團形成共價鍵，在與交聯劑發生共聚合后，用化學方法將印跡分子從這個高度交聯的聚合物上除去。第十五頁，共五十一頁。（3）分子印跡酶通過分子印跡技術可以產生類似于酶的活性中心的空腔，對底物產生有效的結合作用，利用(lìyòng)此技術可以在結合部位的空腔內誘導產生催化基團，并與底物定向排列。應用范圍：分子印跡聚合物可作為剪裁分離物質的材料；在酶技術和有機合成中，可作為模擬抗體、模擬酶或具有催化活性的聚合物；在生物傳感器的構建中作為傳感器。第十六頁，共五十一頁。制備具有酶活性的分子印跡酶，要選擇合適的印跡分子，目前所選擇的印跡分子主要有底物、底物類似物、酶抑制劑、過渡態類似物和產物等。催化活性基團的引入：將催化基團定位在印跡空腔的合適位置對印跡酶發揮(fāhuī)催化效率相當重要。通常引入催化基團的方法為誘導法，即通過相反電荷等相互作用引入互補基團。第十七頁，共五十一頁。（4）生物印跡酶生物印跡是分子印跡的一種形式，它以天然的生物材料，如蛋白質和糖類物質為骨架，在其上進行分子印跡而產生對印跡分子具有特異性識別(shíbié)空腔的過程。用這種方法可以制備生物印跡酶。以蛋白質為基礎制備生物印跡酶的主要過程為：①使蛋白質部分變性；②加入印跡分子，使之與部分變性的蛋白質充分結合；③用交聯劑交聯印跡的蛋白質；④透析等方法除去印跡分子。第十八頁，共五十一頁。第五節酶的化學修飾一、目的(mùdì)和意義天然酶的缺陷：易于變性失活（酸、堿、有機溶劑、熱）；容易受產物和抑制劑的抑制；工業反應要求的酸度和溫度并不總是在酶反應的最適酸度和溫度范圍內；底物不溶于水，或酶的米式常數過高；酶做為藥物在體內的半衰期較短等因素限制了酶制劑的應用。酶的化學修飾：對酶在分子水平上用化學方法進行改造，即在體外將酶分子通過人工方法與一些化學基團，特別是具有生物相容性的大分子進行共價連接，從而改變酶分子的酶學性質的技術。目的：提高酶的穩定性、降低或消除酶分子的免疫原性（醫藥）。意義：擴大了酶制劑的應用范圍，同時化學修飾法也是研究酶的活性中心性質的重要手段。第十九頁，共五十一頁。2、常用化學修飾劑要求：較大相對分子量；良好(liánghǎo)的生物相容性和水容性；分子表面有較多的反應活性基團；修飾后酶的半衰期較長。常用修飾劑：糖及糖的衍生物，右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝膠，聚乳；高分子多聚物，聚乙二醇，聚乙烯醇；生物大分子，肝素，血漿蛋白質，聚氨基酸；雙功能試劑，戊二醛，二胺；其他，固定化酶載體，糖基化試劑，甲基化試劑，乙基化試劑和小分子有機化合物。第二十頁，共五十一頁。3、修飾方法（1）修飾酶的功能基團，酶分子中可解離的基團如氨基、羥基、羧基、巰基等都可以修飾。如脫氨基可消除酶分子表面氨基酸的電荷；通過碳二亞胺反應，可以改變側鏈羧基的性質；通過?；磻筛淖儌孺溋u基的性質。（2）酶分子內或分子間進行交聯，應用某些雙功能試劑可將酶蛋白(dànbái)分子之間、亞基之間或分子內部不同肽鏈部分進行共價交聯。（3）修飾酶的輔因子，可將輔因子共價結合在酶分子上，或引入新的或修飾過的具有強反應性的輔因子。（4）酶與高分子化合物結合，蛋白質或多糖結合后可提高穩定性。第二十一頁，共五十一頁。4、修飾酶的特性穩定性提高、抗各類失活因子的能力提高、抗原性消除、體內半衰期延長、最適酸度改變、酶學性質改變，對組織分布能力改變。5、前景酶分子經過化學修飾后，并不是所有的缺點都可以克服了，并且修飾的結果難以預測，今后，應選用更多的、合適的修飾方法，如使用基因工程法、蛋白質工程法、人工模擬法和某些(mǒuxiē)物理修飾法等，使酶的性質進一步改善。第二十二頁，共五十一頁。第六節酶工程研究(yánjiū)的進展一、有機相的酶反應20世紀80年代中期，A.M.Klibanov等人打破傳統酶學思想的束縛，將酶引入到非水介質中進行催化反應，開辟了非水酶學（nonaqueousenzymology）這一新的研究領域，極大地拓寬了酶的應用范圍。非水酶學的提出，為酶在醫藥、精細化工、材料科學等領域的應用開辟了廣闊(guǎngkuò)的前景。第二十三頁，共五十一頁。有機(yǒujī)相的酶反應1、有機相酶反應的優點

增加疏水性底物或產物的溶解度；熱力學平衡向合成方向移動；可抑制有水參與的副反應；酶不溶于有機溶劑，易于回收在利用；容易從低沸點的溶劑中分離純化產物；酶的熱穩定性提高，酸度適用范圍擴大；無微生物污染；能測定某些在水介質中不能測定的常數；固定化酶方法簡單，可以只沉淀(chéndiàn)在載體表面。第二十四頁，共五十一頁。2、有機相酶反應的溶劑(róngjì)體系水-水溶性溶劑均相體系；水-水不溶性溶劑兩相體系；膠束與反相膠束體系，單相有機溶劑體系。第二十五頁，共五十一頁。3.水和溶劑對有機溶劑中酶的影響酶活力疏水性越強的溶劑，其中酶所要求的水量越少；親水性強的溶劑應加入更多的水以維持酶活力。酶選擇性取決于酶分子的結構，會因酶所處的溶劑不同而發生(fāshēng)巨大變化。酶的穩定性有機溶劑中的水含量對溶劑中酶的穩定性影響很大；有機溶劑中酶的熱穩定性隨系統水含量增加而下降。第二十六頁，共五十一頁。4.有機相的酶工程在有機相中，天然酶容易變性而失活、分散性差、容易聚結成團。因此，酶在有機相中的穩定化研究具有重要的意義。固定化酶不僅使酶在有機相中易于分散，提高擴散效果，而且能增加(zēngjiā)其穩定性，還可以調節和控制酶的活性與選擇性，有利于酶的回收和連續化生產。酶的化學修飾和表面活性劑包埋可以增加酶表面的疏沙發一，改善酶在有機相中的脂溶性和穩定性，提高酶的催化效率。第二十七頁，共五十一頁。二、核酶和脫氧(tuōyǎng)核酶具有催化活性的RNA，即核酶(ribozyme)。根據其催化的反應可分為兩大類：剪切型核酶

催化自身或異體RNA的切割，相當于內切核酸酶，主要(zhǔyào)包括錘頭型核酶、發夾型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白質—RNA復合酶（RNaseP）。剪接型核酶

主要包括組Ⅰ內含子和組Ⅱ內含子，可實現mRNA前體自我拼接，具有內切核酶酶和連接酶兩種活性。第二十八頁，共五十一頁。切割RNA的DNA分子，稱之為脫氧核酶。大多數脫氧核酶的催化需要Mg2+等二價金屬離子作為輔助因子。這些離子的作用是：中和DNA單鏈上的負電荷，從而增加單鏈DNA的剛性；利用金屬螯合作用發揮空間誘導效應；產生H+，誘導并參與體系的電子或質子傳遞，催化體系發生氧化(yǎnghuà)還原反應。第二十九頁，共五十一頁。三、抗體酶利用抗體能與抗原特異性結合的原理，可用過渡態類似物作為半抗原來誘發抗體，這樣(zhèyàng)產生的抗體便能特異地識別反應過程中真正的過渡態分子，從而降低反應的活化能，達到催化反應的目的，這種抗體便稱為催化抗體。催化抗體是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結合的產物，本質上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區賦予了酶的屬性，因此也叫抗體酶?？贵w酶與天然酶相比，最大優點是：種類繁多，不但能催化一些天然酶能催化的反應，還能催化一些天然酶不能催化的反應。第三十頁，共五十一頁?？贵w酶制備方法（1）穩定過渡態法：用類似于反應過渡態的小分子作為半抗原，產生相應的抗體而獲得。（2）抗體與半抗原互補法：利用抗體-半抗原互補性產生抗體酶，通過半抗原的優化設計使之正確模仿過渡態的幾何結構及所有的反應鍵，從而(cóngér)產生高活力的抗體酶。（3）熵阱法：利用抗體結合能克服反應熵壘來設計半抗原。第三十一頁，共五十一頁。利用(lìyòng)過渡態類似物制備抗體酶第三十二頁，共五十一頁。（4）多底物類似法：將酶催化反應的輔因子引入到抗體結合部位，產生既有輔因子結合部位，又有底物結合部位的抗體（5）抗體結合部位修飾法：將抗體的結合部位引入催化基團（6）抗體庫法：用基因克隆技術將全套(quántào)抗體重鏈和輕鏈可變區基因克隆出來，重組到原核表達載體，通過大腸桿菌直接表達有功能的抗體分子片段，從中篩選特異性的可變區基因。第三十三頁，共五十一頁。對于任何分子，幾乎都可以通過免疫系統產生相應的抗體，而且專一性很強，抗體的這種多樣性標志(biāozhì)著抗體酶的應用潛力是巨大的。第三十四頁，共五十一頁。四、基因工程(jīyīngōngchéng)酶的構建1、酶基因的克隆和表達重組(zhònɡzǔ)DNA技術克隆各種天然酶的基因，在微生物中表達，篩選出高產菌株，可以通過發酵大量生產所需要的酶。2、酶基因的遺傳修飾人為地將酶基因中個別核苷酸加以修飾或更換，從而改變酶蛋白分子中某個或幾個氨基酸，不僅改變酶的結構，而且改變拜的催化活力，專一性及穩定性。第三十五頁，共五十一頁。第七節酶工程產品(chǎnpǐn)制造實例酶工程具有技術先進、廠房設備投盜小、工藝簡單、能耗量低、產品收率高、效率高、效益大、污染輕等優點。

以往采用化學合成、微生物發酵及生物材料提取等傳統技術生產的藥品，都可以通過酶工程生產，甚至可以獲得傳統技術不可能得到(dédào)的昂貴藥品。第三十六頁，共五十一頁。一、固定化細胞法生產(shēngchǎn)6-氨基青霉烷酸青霉素G經青霉素酰化酶作用，水解除去側鏈后的產物稱為6-氨基青霉烷酸，也稱無側鏈青霉素。6-氨基青霉烷酸是生產半合成青霉素的最基本原料。1、工藝路線（1）大腸桿菌的培養斜面培養基為普通肉湯瓊脂(qióngzhī)培養基，發酵培養基的成分為蛋白胨、氯化鈉、苯乙酸、自來水。用氫氧化鈉調酸度為7.0，在55。16kP下滅菌30分后備用。在250毫升搖瓶中加入發酵液培養液30毫升，將斜面接種后培養18-30小時的大腸桿菌D816（產青霉素?；福?，用15毫升無菌水制成菌細胞懸液，取1毫升懸浮液接種至裝有30毫升發酵液培養基的搖瓶中，在搖床上28℃，170轉每分振蕩培養15小時，如此依次擴大培養，直至1000-2000升規模通氣攪拌培養，培養結束后用高速管式離心機收集菌體，備用。第三十七頁，共五十一頁。（2）大腸桿菌固定化取濕菌體100公斤，置于40度反應罐中，在攪拌下加入50升10%戊二醛5升，在轉移至搪瓷盤中，使之成為3-5厘米厚的液層，室溫放置2小時，再轉移至4度冷庫過夜，待形成固體凝膠后，通過粉碎和過篩，使其成為直徑為2毫米左右的顆粒狀固定化大腸桿菌細胞，用蒸餾水以酸度7.5和0.3摩爾每升磷酸緩沖液先后充分洗滌，抽干，備用。（3）固定化大腸桿菌反應堆制備(zhìbèi)將上述充分洗滌后的固定化大腸桿菌細胞裝填于帶保溫夾套的填充式反應器中，即成為固定化大腸桿菌反應堆，反應器規格為直徑70*160厘米。第三十八頁，共五十一頁。（4）轉化反應取20公斤青霉素G鉀鹽，加入(jiārù)到1000升配料罐中，用0.03摩爾每升、pH7.5的磷酸緩沖液溶解并使青霉素G鉀鹽濃度為3%，用2摩爾每升氫氧化鈉溶液調pH至7.5-7.8，然后將反應器及pH調節罐中反應液溫度升到40度，維持反應體系的酸度在7.5-7.8范圍內，以70每分70升流速使青霉素G鉀鹽溶液通過固定化大腸桿菌反應堆進行循環轉化，直至轉化液酸度不變為止。循環時間一般為3-4小時，反應結束后，放出轉化也8，再進入下一批反應。第三十九頁，共五十一頁。（5）6-氨基青霉烷酸的提取

上述轉化液經過濾澄清后，濾液用薄膜濃縮器減壓濃縮至100升左右，冷卻至室溫后，于250升攪拌罐中加50升醋酸丁脂充分攪拌提取10-15分，取下層水相，加1%克每毫升活性炭于70度攪拌脫色30分，濾除活性炭，濾液用6摩爾每升鹽酸調酸度至4左右，5度放置結晶(jiéjīng)過夜，次日濾取結晶(jiéjīng)，用少量冷水洗滌，抽干，115℃烘2-3小時得成品6-氨基青霉烷酸，收率為70-80%。第四十頁，共五十一頁。二、固定化酶法生產(shēngchǎn)5’—復合單核苷酸5'—復合(fùhé)單核苷酸可用于治療白血球下降、血小板減少以及肝功能失調等疾病。核糖核酸經磷酸二脂酶作用，可分解為腺苷、胞苷、尿苷、鳥苷等一磷酸化合物，該磷酸二脂酶存在于桔青霉細胞、谷氨酸發酵菌細胞、麥芽根等生物材料中，本法以麥芽根為材料制備磷酸酶。第四十一頁，共五十一頁。工藝路線：1、磷酸二脂酶的制備取干麥芽根，加9-10倍體積的水，用2摩爾每升的鹽酸調酸度至5.2，于30度條件下浸泡15-20小時，然后加壓去渣，浸出液過濾(guòlǜ)，濾液冷卻至5度，加入2.5倍體積的5度95%冷工業酒精，5度靜置2-3小時后，吸去上層清夜，回收乙醇，下層離心收集沉淀，用少量丙酮以乙醚先后洗滌2-3次，真空干燥，粉碎得到磷酸二脂酶，備用。第四十二頁，共五十一頁。2、固定化磷酸二脂酶的制備取上述磷酸二脂酶200克，用1.5%硫酸銨溶液溶解，過濾得到酶液。另取濕ABXE-纖維素40公斤，加入0-5度蒸餾水至80升，攪拌下先后加入1摩爾每升鹽酸和5%亞硝酸鈉溶液各10升，攪拌均勻，于0-5度下反應，150分，抽濾，濾餅迅速用預冷的0.05摩爾每升鹽酸和蒸餾水各洗3次，抽干(chōuɡàn)后，將濾餅投入上述磷酸二脂酶溶液中，攪拌均勻后用1摩爾每升碳酸鈉溶液調pH8.0，攪拌反應30分，用冷水洗3-4次，抽干(chōuɡàn)，得到固定化磷酸二脂酶，備用。第四十三頁，共五十一頁。3、轉化(zhuǎnhuà)反應取2公斤核酸，緩慢假如預熱至60-70度的360升、pH5.00.001摩爾每升氯化鋅溶液中，用摩爾每升氫氧化鈉溶液調至pH5.0-5.5，濾除沉淀，將清液升溫至70度，加入上述濕的固定化磷酸二脂酶40公斤，，于67度維持pH5.0-5.5，攪拌反應1-2小時，根據增色效應，用紫外吸收法判斷轉化(zhuǎnhuà)平衡點，轉化(zhuǎnhuà)完成后，濾出轉化(zhuǎnhuà)液，用于分離5’—單核苷酸，固定化酶再繼續用于下一批轉化(zhuǎnhuà)反應。第四十四頁，共五十一頁。4、5’—復合單核苷酸的分離純化將上述轉化(zhuǎnhuà)液用6摩爾每升的鹽酸調酸度至3，濾除沉淀，，濾液用6摩爾每升氫氧化鈉調酸度至7，進入已處理好的氯-型陰離子交換樹脂柱，流速為2-2.5升每分，吸附后，用250-300升去離子水洗滌柱床，然后用3%氯化鈉溶液以1-1.2升每分流速洗脫，當流出液pH達到7時開始部分收集，直至洗脫液中不含核苷酸為止，合并含核苷酸鈉的洗脫液進行精制。第四十五頁，共五十一頁。5、精制及灌封上述核苷酸鈉溶液用薄膜濃縮器濃縮后，測定核苷酸含量，再用無熱源水稀釋至20毫克每毫升，加入0.5-1.0%藥用活性炭，煮沸10分，脫色和除熱源，濾除活性炭，濾液經除6號菌漏斗或0.45微米孔徑的微孔(wēikǒnɡ)濾膜過濾除菌后灌封，即為5’—復合單核苷酸。第四十六頁，共五十一頁。三、固定化酶法生產(shēngchǎn)L-氨基酸氨基酸可用于醫藥、食品以及農業。合適比例的混合液可直接注入體內補充營養，