課程考核學位類型：學科、領域：食品科學與工程研究方向：導師姓名：學生姓名：學號：入學時間：授課教師：課程名稱：考核時間：多肽的制備及其功能活性的研究進展摘要科學研究發現生物體內存在多種具有生理活性的多肽物質，它們具有不同的結構和功能活性。人體攝入的蛋白質經酶水解后，主要以肽的形式被消化吸收。幾乎所有細胞都受多肽調節，它具有調節機體生理功能和為機體提供營養的雙重功效。人們已從包括人、植物、動物在內的各種生物體中分離出各類活性多肽，并且對多肽的性質、制備方法、分離純化方法、鑒定技術、功能活性及應用等方面進行了大量的研究，并取得了一定的成效。本文概述了不同來源多肽的制備方法和其功能活性研究進展,對多肽的多種功能活性進行了介紹。關鍵字：多肽；功能活性；分離純化ABSTRACTScientificstudieshavefoundthatorganismsexistavarietyofphysiologicallyactivepeptideswhichhavedifferentstructureandfunctionalactivity.Aftertheproteinsintakenbyhumansarehydrolyzed,theywillbedigestedandabsorbedintheformsofpeptides.Almostallcellsareregulatedbypeptideswhichregulatethebody'sphysiologicalfunctionandprovidenutrientsforthebody.Peoplehaveisolatedallkindsofactivepeptidesfromavarietyoforganisms,includingpeople,plants,animalsandhavedonealotofresearchandapplicationofthenatureofpeptides,preparationmethods,purificationmethods,identificationtechnology,functionalactivity,etc,andachievedsomeresults.Thisarticlesummarizesamethodforpreparingactivepeptidesandtheprogressoffunctionalactivity.Keywords:peptides;Functionalactivity;Separationandpurification近年來，多肽在生物體內的生理功能受到越來越多的重視。大量研究結果表明，蛋白質由于其分子量大，結構復雜，攝人人體后不易被消化吸收，從而影響了其生理功能和營養價值的有效發揮。多肽是比蛋白質結構簡單，分子量小，由2-16個氨基酸通過肽鍵連接的一類化合物，按氨基酸組成數目可人為分為短肽(2-5個氨基酸)，多肽(6-16個氨基酸)。多肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質。科學發現，幾乎所有細胞都受多肽調節，如：細胞分化、神經激素遞質調節、免疫調節等均與活性多肽密切相關，它具有調節機體生理功能和為機體提供營養的雙重功效。由于多肽具有調節植物神經系統、活化細胞免疫機能、改善心血管功能和抗衰老等生理活性，這為開發肽藥物、肽類保健食品提供了理論依據。可見，進行多肽的研究和開發有著十分重要的研究意義和應用前景[1]。1多肽的制備方法目前，國內外制備多肽的方法主要有：蛋白酶水解法、化學合成法、基因重組法、分離提取法等。酶法生產功能性多肽應用較為普遍[2]。龔吉軍等人[3]利用茶籽蛋白酶酶解制備菜籽多肽，確定了最佳條件，此條件下氨基酸態氮生成率可達34．64％，制備的茶籽多肽對超氧自由基和羥基自由基具有強烈的清除作用；李書國等人[4]研究了酶法生產大豆多肽的加工工藝，分離得到純凈的酸性水解物溶液，水解率高達95％；班玉鳳等人[5]研究了Alcalase水解大豆蛋白制備大豆蛋白寡肽的方法，確定了酶解的最佳條件，其水解液的水解度達到了24.1％；劉大川等[6]也利用堿性蛋白酶對富硒菜籽分離蛋白酶解制備蛋白肽，水解度達32．51％，制得的富硒菜籽蛋白肽分子量分布較好，幾乎完全是小分子多肽，分子量均在1500D以下。以下是幾種方法優缺點的概述。1.1化學水解酸解法水解度不易控制，容易使氨基酸遭到破壞；堿解法能使L-氨基酸形成D-氨基酸，可能存在營養和毒理方面有害的效應，對于食品多肽的生產不足取，所以這兩種方法都很少被使用破壞L型氨基酸。1.2酶法能在一定條件下進行定位水解產生特定的肽，且易于控制水解進程，并且具有高度的專一性，一般不會導致營養方面的損失，也不會產生毒理學上的問題，同時酶作用具有特異性，可在溫和條件下進行，因而能較好的滿足肽的生產需要。1.3發酵法直接利用微生物發酵過程中產生的蛋白酶降解蛋白，可達到較高的水解率，該技術的要求相對較高，對菌種的依賴性較大，，本質也是酶解。目前采用較多的是酶法。酶法因其水解條件溫和，水解度易控制，無環境污染的特點，備受推崇。而酶解法中雙酶或多酶協同水解的方式又多被采用。因為這種方式生產下的水解液水解度大、苦味低、多肽種類多。現在蛋白質的水解一般都用酶法水解，在多肽的生產中酶的選擇是關鍵，它不僅影響最后產品的得率，反應速度，而且直接影響產品的風味和理化特性，現有的酶解工藝多采用單酶水解，易產生苦，澀等不良風味影響了食用的要求，因此通常采用復合酶水解，例如：內肽酶和端肽酶，alcalase與flavourzyme得組合酶等。在蛋白質的酶解過程中水解度的控制是十分重要的參數因為過度的水解會產生苦味肽，影響水解蛋白在食品中的應用[7]。多肽制備的一般步驟：原料-前處理-提蛋白-干燥-蛋白粉-酶-滅酶-離心分離-多肽液-干燥-多肽粉。2多肽含量的測定2.1雙縮脲法雙縮脲反應：在強堿性溶液中雙縮脲與硫酸銅反應可生成紫色絡合物，其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，在540納米處測吸光值。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵都可發生雙縮脲反應。2.2OPA法（鄰苯二甲醛法）使用于乳源性的多肽測定，反應試劑：含有25ml100mM的硼砂2.5m120(w/w)SDS、40ragOPA(鄰苯二甲醛溶于lml甲醇)，再用去離子水定容至50ml，用不同濃度的胰蛋白酶水解的酪蛋胨(多肽)來制作標準曲線，50/11樣品溶液與2ml試劑室溫下反應2min，在340nm下比色，查標準曲線即可以得到多肽的含量。3.3紫外吸收法蛋白質溶液在238nm處的光吸收的強弱，與肽鍵的多少成正比，所以此法適用于多肽的含量測定。因此可以用標準蛋白質溶液配制一系列50-500fg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質溶液，測定238nm的光吸收值A238，以A238為縱坐標，蛋白質含量為橫坐標，繪制出標準曲線。未知樣品的濃度即可由標準曲線求得。多種有機物，如醇、酮、醛、醚、有機酸、酰胺類和過氧化物等都有干擾作用。所以最好用無機鹽，無機堿和水溶液進行測定。若含有有機溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質，然后用水、稀酸和稀堿溶解后再作測定[8]。3多肽的分離純化隨著現代生物技術的發展，用于蛋白質及多肽分離純化的方法日益先進。常用的提取分離法包括：化學萃取法(如：醇法、丙酮法)、陰陽離子交換吸附柱、Sephadex凝膠過濾柱、凝膠電泳、高效液相色譜(HPLC)、高效毛細管電泳法(HPCE)等方法。Chen等人[9]利用水醇提取法，結合離子交換、凝膠過濾和RP—HPLC從人參中分離到六種含僅氨基酸的小肽。郝林琳等人[10]采用醋酸溶液和乙醇提取了6支鮮二杠馬鹿茸的主干頂部、中部、根部3個部位的多肽。金聲等人[11]將罌粟的花粉水提取液經H+型陽離子交換柱，Sephadex凝膠過濾柱和HPLC系統提取分離得到了四種多肽。4多肽的活性研究4.1易消化吸收作用過去人們認為，人體主要是以氨基酸的形式吸收蛋白質，但現代營養學研究發現人體攝入的蛋白質經消化道中的酶水解后，主要以寡肽的形式被消化吸收，以游離氨基酸形式吸收的比例很小，所以，多肽比完全游離氨基酸更易更快地被機體吸收利用，且蛋白質以多肽的形式被吸收，也有利于最大限度地利用其生物活性功能。尤其對于消化功能受損的人群，他們的食物蛋白質的吸收受到嚴重限制和影響，蛋白質、氨基酸循環被破壞，體內不能合成多肽，若直接服用多肽即可補充蛋白質，又可以維持正常的代謝平衡。4.2.降血壓作用AcEI抑制肽能抑制血管緊張素轉化酶(ACE)的活性，而血管中的AcE能使血管緊張素Ⅱ生成，從而引起末梢血管收縮致使血壓升高。可見AcEI抑制肽能夠間接阻止血管緊張素Ⅱ的生成，進而起到降低人體血壓的作用，是預防和治療高血壓的有效多肽類物質。江南大學劉萍等人利用酶法水解玉米蛋白粉生產降血壓肽，結果表明堿性蛋白酶水解玉米蛋白獲得的水解液在水解度為15.96%時水解液的ACE抑制率最高，IC50值為0.125mg\ml[12]。張焱等人利用胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶分別水解大豆蛋白，制備具有ACE抑制活性的大豆多肽，結果表明堿性蛋白酶是最佳的水解酶，當酶與底物比為2.0，反應時間為80分鐘，溫度為55℃時可制備出高ACE抑制活性的大豆多肽[13]4.3.降血脂和降膽固醇作用人們早在20世紀初就觀察到植物蛋白的水解產物蛋白肽具有比植物蛋白本身更有效的降血脂、降膽圄醇的作用。有研究分析，多肽能刺激甲狀腺激素分泌增加，促進了膽固醇的膽汁酸化，使糞便排泄膽固醇增加，從而起到降低血液膽固醇的作用。許多動物實驗和臨床試驗表明：大豆多肽中，分子相對質量大于5000D的部分具有明顯降低膽固醇的作用；并且只對膽固醇值高的人有降低膽固醇的作用，對正常人沒影響。4.4抗菌作用抗菌肽又稱為微生物肽或肽抗生素，是指存在于生物體內具有抵抗外界微生物侵害，消除體內突變細胞的一類由生物細胞特定基因編碼產生的小分子多肽。抗菌肽是動物機體具有天然免疫力的重要原因，對動物的非獲得性免疫具有特殊意義。它們的堿性基團和微生物的細胞膜有著很強的親和性，可通過增加細胞膜的通透性殺死微生物。西南大學食品學院霍健聰等人：以帶魚下腳料為原料，制備多肽亞鐵螯合物，并研究亞鐵鰲合物的抑菌活性[14]。利用風味酶和動物復合蛋白酶雙酶法制備水解液，采用氯化亞鐵螯合。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等為測試菌株，，采用牛津杯雙層平板法確定亞鐵螯合物的抑菌中濃度及探討pH和溫度對亞鐵螯合物抑菌活性的影響。結果表明：(1)最佳酶解條件為帶魚下腳料蛋白用量4.1g/100mL，溫度4O℃，復合比l:1，酶量6×10IU/100mL，pH7；(2)帶魚下腳料蛋白最佳螯合條件為：pH7，時間15min，溫度20℃,抗壞血酸用量0.1％;(3)抑菌活性試驗結果表明：亞鐵螯舍物對所選取的測試菌株除普通變形桿菌外都有一定抑菌作用，其中對巨大芽胞桿菌抑茵效果最好；在酸性條件下抑茵活性仍然較高，但在堿性環境中抑菌活性明顯降低；在較低溫度下保持抑茵活性，但高溫處理后抑菌活性顯著降低。亞鐵螯合物對各測試菌株除普通變形桿菌之外均有較強的抑菌活性，是一種對細菌較為廣譜的抑菌劑。4.5.抗氧化作用抗氧化性多肽是生物活性肽的一種。抗氧化機理包括通過給抗氧化酶提供氫、緩沖生理pH、螯合金屬離子和捕捉自由基等途徑起到抗氧化作用。科學研究表明自由基可引起蛋白質損傷、脂質過氧化、核酸損傷等，進而誘發各種疾病。而抗氧化多肽具有清除自由基、防止脂質過氧化等作用，將其添加到功能保健食品中，具有預防多種疾病的作用。抗氧化性多肽還能作為天然抗氧化劑防止油脂氧化，緩衰老的作用。河南工業大學史軍，王金水等人[15]利用花生蛋白經過堿性蛋白酶ALCALASE、復合蛋白酶PROTAMEX水解得到活性肽溶液．通過單因素試驗及正交試驗得到各個因素的優化組合，并進一步研究活性肽的抗氧化特性．結果表明，ALCALAsE對花生蛋白的水解能力優于PROTAMEX，花生肽具有較強的抗氧化性及有效清除羥自由基的能力。4.6促進礦物質吸收某些蛋白肽可通過與人體必需的礦物離子形成螯合物，使鈣、鐵等離子維持在可溶狀態，從而促進機體對礦物質的吸收。如將從牛乳中提取的酪蛋白磷酸肽CPP，也稱為促鈣吸收肽，添加到兒童和婦女及老年食品中，則可促進鈣的吸收。近一個世紀的研究表明，肽是由20個天然氨基酸以不同的組成和排列方式構成的二肽到復雜的線性和環形結構的不同肽類總稱，是源于蛋白質的多功能化合物。活性肽廣泛存在于自然界中，生物體很多活性物質都以肽的形式存在，沒有肽，就沒有活性，沒有生命[16]。科學家們研究發現了具有免疫調節、激素調節、酶調節、抗病毒、降血壓和降血脂等功能性肽[17-18]。由于功能性肽的特殊功能，使得人們對它的需求增加，現在已提取出的多種功能性肽多用于醫用和保健，如功能性大豆蛋白肽已經用于降血脂。伴隨著需求，人們對肽的結構和功能研究也逐漸深入。5展望近年來,活性多肽的開發越來越受到世界各國的關注,并取得了一定的進步。但由于多肽研究水平仍處于初級階段,技術水平有待進一步提高,這極大限制了蛋白質資源的有效利用,有些蛋白質資源被當作粗飼料、燃料甚至作為廢棄物丟棄。因此,進一步研究活性多肽的制備方法,明確其保健功能的作用機理,開發出有價值的保健功能食品,對提高各種來源蛋白質深加工的轉化率和利用率具有重要的現實意義,同時也為綜合利用蛋白質資源提供了一條有效途徑。生物活性多肽作為食品不僅能提供人體生長發育所需的營養物質,還能起到調節人體生理功能的作用。它不僅對于整個食品工業的各個領域,而且對于醫藥、化妝品、生物、保健等許多領域的發展均有著重要意義。生物活性多肽開發成具有多種營養保健功能的多肽保健營養品、多肽藥物、食品添加劑等,有著廣泛的發展前景。相信,隨著多肽的制備方法、功能特性及營養價值等內容更深入廣泛的研究,將會有越來越多的不同來源、不同制備方法的生物活性多肽廣泛應用于食品和醫藥等行業中。參考文獻[1]勵建榮，封平．功能肽的研究進展[J]．食品科學，2004，25(11)：415－419．[2]孔令明，等．多肽的功能活性與研究進展[J]．中國食品添加劑，2009，03，71－73．[3]龔吉軍，李忠海，鐘海雁，等．茶籽多肽的制備及抗氧化活性研究[J]．食品研究與開發，2007，28(10)：59－6l．[4]李書國，陳輝，杜進民，等．大豆多肽的功能特性及加工藝[J]．糧油食品科技，2000，8(1)：14－15．[5]班玉鳳，朱海峰，孫明珠．水解大豆蛋白制備大豆蛋白寡肽的研究[J]．現代食品科技，2007，23(11)：5l－53．[6]劉大川，周俊梅，張寒俊．富硒菜籽蛋白肽的制備工藝研究[J]．中國糧油學報，2006，21(3)：245－249．[7]李志忠，袁惠君，張丙云，等．大豆多肽的功能與開發研究[J]．甘肅科技，2006，22(