關于氨基酸與蛋白質的一級結構第1頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五蛋白質種類與功能的多樣性1010-1012結構蛋白貯藏蛋白收縮蛋白轉運蛋白第2頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五第一節氨基酸180多種天然AA，大多數是不參與蛋白質組成的。這些AA被稱為非蛋白質AA。參與蛋白質組成的AA為蛋白質AA，常見的只有20種

基本氨基酸，標準氨基酸表達方式：三字母或單字母的簡寫符號第3頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五（一）-氨基酸的結構通式除脯氨酸外，其他19種均具有如下結構通式。各種氨基酸的區別在于側鏈R基的不同。-氨基酸可變部分不變部分一、基本氨基酸第4頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五(二)常見的標準AA－20種1,按側鏈R基的化學結構，分為三類脂肪族氨基酸—15種C2:1C3:3C4:3C5:4C6:4芳香族氨基酸－3種雜環族氨基酸－2種第5頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五脂肪族氨基酸第6頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五芳香族氨基酸－3種第7頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五雜環族氨基酸第8頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五GlyAlaValLeuIlePheTyrTrpCysMetSS氨基酸的R基大小第9頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五2，根據酸堿性分類:

酸性氨基酸:2個–COOH、1個-NH2

Asp，Glu

堿性氨基酸:1個–COOH、2個堿性基團

（胍基、氨基、咪唑基）

Arg，Lys，His

中性氨基酸:1個–COOH、1個-NH2

第10頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五3，按R基的極性性質分為4類：非極性氨基酸：9

極性不解離：6極性氨基酸解離帶負電荷：2酸性極性解離解離帶正電荷：3堿性

第11頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五POLARNON-POLARTyrHisGly酸性中性BasicAspGluGlnCysAsnSerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpPro氨基酸的極性分類極性或非極性，是影響蛋白質結構與性質的關鍵第12頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五--+++SS有大有小有正有負有極性非極性

形形色色的氨基酸側基

第13頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五特殊氨基酸含硫氨基酸含羥基氨基酸-Cβ帶分支氨基酸二羧基一氨基氨基酸二氨基一羧基氨基酸亞氨基酸第14頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五三、氨基酸的構型和旋光性*除甘氨酸外，皆含手性C，皆為L-構型（蛋白中的氨基酸）；旋光方向不同。左或右旋。旋光儀測定。比旋光度[α]D25(單位濃度、單位長度下的旋光度，＝α/c*l)是氨基酸的重要物理常數之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據。第15頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五四：特征光吸收在近紫外區(200-400nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm，色氨酸的max＝280nm苯丙氨酸的max＝257nm第16頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五五氨基酸的酸堿性質一）氨基酸的兼性離子形式：氨基酸的兩個重要性質：氨基酸晶體的熔點高（200C）；氨基酸使水的介電常數增高。AA是兩性電解質第17頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五COOHNH2

H+COO-R

-

C

-

HNH2

H+R

-

C

-

HCOO-NH2R

-

C

-

H酸性環境中性環境堿性環境+1-10pK1~2pK2~9.4等電點6.0等電點pI：所帶凈電荷為零。電場中不移動。第18頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五此氨基酸在pH2或9附近，有緩沖作用。第19頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五第20頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五賴氨酸的解離及等電點計算HA2+A+A0A-第21頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五等電點(isoelectricpoint,pI)：分子呈電中性時溶液的pH值。為兼性離子兩側解離基團的算術平均值。中性氨基酸：酸性和堿性基團的算術平均值：pI=(pK’-COO-+pK’-NH2)/2，pI～6

酸性氨基酸：兩個酸性解離基團的算術平均值pI=(pK’-COO-+pK’R-COO-

)/2，pI～2堿性氨基酸：兩個堿性解離基團的算術平均值pI=(pK’-NH2+pK’R-NH2)/2，pI>7

第22頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五不同pH值時所帶電荷

pH=pI氨基酸呈電中性，電泳不移動

pH<pI氨基酸帶正電荷，向陰極移動

pH>pI氨基酸帶負電荷，向陽極移動在一定pH范圍中，溶液的pH離AA等電點愈遠，AA帶凈電荷愈多，泳動速度越快。第23頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五補充：化學性質亞硝酸反應烴基化反應酰化反應脫氨基反應西佛堿反應成鹽成酯反應成酰氯反應脫羧基反應疊氮反應側鏈反應茚三酮反應成肽反應第24頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五除Pro生成黃色化合物外,其它AA生成藍紫色化合物（570nm）;

與茚三酮反應（27）用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。茚三酮水合茚三酮第25頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五補充：含氮量穩定氨基酸的結構通式為α氨基酸。蛋白質除含C,H,O外，還含有N。AA平均分子量為110。不同蛋白的含氮量皆在16%左右。只需測定N含量，N含量/16%即為蛋白含量。

----凱氏定氮法的理論基礎第26頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五第二節、氨基酸的分離分析根據R基的極性。原理：分配層析。

①濾紙層析：②薄層層析：根據氨基酸的凈電荷及R基的極性：

③離子交換層析：陰離子交換樹脂-N(CH3)3OH，陽離子交換樹脂-SO3H根據氨基酸的凈電荷及質點大小：

④電泳：第27頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五分配層析的一般原理

層析法――色層分析法（色譜）

系統的組成固定相（靜相）

流動相（動相）分配定律――當溶質在兩種給定的互不相溶的溶劑中分配時，在一定的溫度下達到平衡后，溶質在兩相中的濃度比值為一常數.此比值即分配系數（kd）。第28頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五一）紙層析固定相：纖維素上吸附的水

流動相：展層溶劑，有機相

層析時，混合AA在兩相中不斷分配，疏水性強的AA在固定相水中溶解度較小，與水的作用力也較小，隨展層劑的展層（移動）也移動較遠距離（遷移率Rf大）。極性強的Rf值小，疏水性強的Rf大。分離、鑒定AA混合物的方法。第29頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五將下列每組混合物分別用正丁醇-醋酸-水進行紙層析，指出每組的相對遷移率。(1)Val和Lys;(2)Phe和Ser;(3)Leu、Ala、Ser第30頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五第三節肽和蛋白質一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。一、肽、肽鍵與肽鏈由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由幾個到幾十個氨基酸組成的肽稱為寡肽，由更多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成肽鏈的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。第31頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序。方向性：一條多肽鏈有兩個末端，自由-氨基，稱為氨基端或N-端；游離-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序：N-端→C-端如上述五肽可表示為：Ser-Val-Tyr-Asp-Glu

絲氨酰纈氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酸肽單位主鏈：側鏈第32頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五二、肽的解離性質肽具有酸堿兩性性質和等電點。肽的酸堿性質主要來自游離末端-NH2和游離末端-COOH以及側鏈R上可解離的基團。每一種肽都有其相應的等電點。末端-NH2,-COOH比游離氨基酸的酸堿度降低。

第33頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五第34頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五三、生物活性肽在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。部分肽中含有D-氨基酸。第35頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五

CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCH2CH2CHNH2COOHCH2SH

1.參與體內氧化還原反應2.作為輔酶參與氧化還原反應保護巰基酶或含Cys的蛋白質中

SH的還原性防止氧化物積累GSH+GSH----GSSG第36頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五第四節、蛋白的分離根據：所要提取的蛋白（目的蛋白）與其它蛋白（雜蛋白）的不同進行分離。■溶解度不同:反相柱層析；鹽析

■分子量不同:透析；凝膠過濾法■所帶電荷不同:電泳；離子交換層析

特有的親和力：親和層析第37頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五一）鹽析法：溶解度不同不同的蛋白質溶解度不同。且溶解度隨外界條件如鹽濃度，pH值，溫度等而變。■

鹽對蛋白質濃度的影響●鹽溶

Salting-in:

加少量鹽使蛋白質溶解度變大●鹽析

Salting-out:加大量鹽使蛋白質由溶液中沉淀出來第38頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五■

蛋白質溶解度和pH值及鹽濃度有關0.0010.0050.01

0.02[NaCl](mol/L)pI4.85.05.25.45.6pH溶解度蛋白的穩定因素：（1）帶電層（2）水化層加入少量鹽：增加帶電層，促進溶解。

--------鹽溶第39頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五Aggregate蛋白質分子表面的疏水性區域，聚集許多水分子，當加入鹽時，這些水分子被抽出，暴露出來的疏水性區域互相結合，形成沉淀。■

鹽析

Salting-out：Ionicstrength溶解度+-+++-----+AmmoniumsulfateSodiumsulfateAlittlesalting-ineffectNH4+SO42-=hydrophobic第40頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五不同蛋白的溶解度曲線

硫酸銨分級沉淀第41頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五二）凝膠過濾法：分子量不同又稱為分子篩層析。依蛋白質分子量的差異，通過具有分子篩性質的凝膠而分離。葡聚糖凝膠G10-G200瓊脂糖凝膠2B,4B,6B聚丙烯酰胺凝膠S100－S600第42頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五■凝膠顆粒第43頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五小分子進入凝膠分子內，被滯留大分子在凝膠顆粒間移動，較快流出溶劑流動方向按分子量從大到小依次流出第44頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五問題：已知下列蛋白的分子量。問以凝膠過濾法洗脫時蛋白質的洗脫順序如何？（凝膠分級范圍為5000～400，000）④②⑤①③第45頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五三）親和層析法：特定親和力如兩分子間有專一性親和力（特別的結合和識別能力，具有針對性），以其中一種作為“魚餌”，可把另外一種“釣”出來。其它蛋白不被吸引而結合不上。第46頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五■親和層析法的作用機理：固相載體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團的配體XBAA第47頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五四）蛋白電泳在外電場的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動，這種現象稱為電泳。蛋白質有各自的等電點。在非等電點時，蛋白質顆粒均帶有不同的電荷。蛋白質顆粒在電場中移動的速度（v）取決于電場強度(E)，所帶的凈電荷(q)以及與介質的摩擦系數(f，即顆粒大小及形狀)。第48頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質中的氨基酸殘基按大約12比例結合，使蛋白以一條無構型的長條分子存在，且分子表面均勻結合一層負的SDS的電荷，蛋白質分子原有電荷間的差別則可以忽略。用已知分子量的蛋白質作為標準，則可以估算出不同蛋白質的分子量。第49頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五第50頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五第五節蛋白質一級結構的測定定義——1969年，國際純化學與應用化學委員會（IUPAC）規定：蛋白質的一級結構指蛋白質多肽連中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。第51頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五F.Sanger

(1953,CambridgeU)

Insulin胰島素(A,Bchains)以傳統氨基酸定序法決定蛋白質序列SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT

B-chain

A-chain第52頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五一）、Edmandegradation降解法測定氨基酸順序的一般測定步驟（1）測定多肽鏈的數目，拆分多肽鏈，分析多肽鏈的N末端和C末端殘基（2）斷裂多肽鏈內、間的二硫鍵（3）測定每條多肽鏈的AA組成（4）多肽鏈斷裂成小肽段

（5）測定各個肽段的AA順序（6）確定肽段在多肽鏈中的次序

（7）確定原多肽鏈中二硫鍵的位置第53頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-肽）。酸解，得黃色DNP-氨基酸，用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。（一）N末端分析法二硝基氟苯（DNFB）法是游離氨基酸、多肽及蛋白共有的一個反應第54頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質NH2末端氨基酸.DNS

+

AA多肽蛋白弱堿DNS-AA多肽蛋白酸DNS-AA

+游離AA（乙醚抽提，有熒光）丹磺酰氯法第55頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五(二)二硫鍵的斷裂在可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍（使蛋白變性，亞基分開）存在下，使用過量的-巰基乙醇，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。第56頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五(三)氨基酸組成的分析：酸，堿解后氨基酸分析儀測定第57頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五（四）多肽鏈的部分水解1、酶裂解法

胰蛋白酶

蛋白水解酶（蛋白酶）：糜蛋白酶（肽鏈內切酶）

嗜熱菌蛋白酶

胃蛋白酶

第58頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五胰蛋白酶Trypsin

：R1=賴氨酸Lys和精氨酸Arg側鏈（專一性較強，水解速度快）。胰凝乳（糜）蛋白酶：專一性﹤胰蛋白酶

斷裂Phe,Trp,Tyr等芳香族AA的羧基形成的肽鍵。水解位點2、化學試劑法：溴化氰。R1=甲硫氨酸。第59頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五五）氨基酸序列的測定1、Edman化學降解法Edman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實際上也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷重復循環，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。第60頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五

用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質NH2末端氨基酸。亦稱Edman反應弱堿

AAPITC+多肽蛋白

AAPTC—多肽蛋白無水甲酸或HFPTH-AA+少一個AA的多肽或蛋白（乙酸乙酯抽提）苯異硫氰酸酯（PITC）法：第61頁，共69頁，2022年，5月20日，9點32分，星期五此反應可循環進行進行n輪反應，可測出n個殘基順序一次：60－70個殘基的肽段順序第62頁，共69