1、半抗原免疫原的制備半抗原免疫原的制備物理方法：利用通過電荷和微孔吸附半抗原 吸附的載體有羧甲基纖維素 （ CMC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、硫酸葡聚糖等 3、半抗原與載體的連接方法化學方法：利用某些功能基團將半抗原連接到載體上 帶有游離氨基或羧基以及兩種基團都有的半抗原：碳二亞胺法 戊二醛法 混和酸酐法 不帶氨基和羧基的半抗原：用化學方法使其轉變為帶有游離氨基或游離羧基的衍生物，再與載體連接 - 琥珀酸酐碳二亞胺法 半抗原免疫原的制備2物理方法：利用通過電荷和微孔吸附半抗原3、半抗原與載體的連 四、佐劑* 概念：與抗原同時或預先注射于機體，能增 加機體免疫應答或改變免疫應答類型的物質。 條件

2、：增加抗原的表面積； 改變抗原的活性基團構型； 佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時間； 可直接或間接激活免疫活性細胞； 無毒性或無副作用。四、免疫佐劑半抗原免疫原的制備3 四、佐劑* 概念：與抗原同時或預先注射于機體，能 化合物:氫氧化鋁、明礬、礦物油、吐溫-80、弗氏不完全佐劑以及人工合成的多聚肌苷酸 胞苷酸(poly IC)、脂質體 生物制劑:處理改造的細菌及代謝產物，如卡介苗、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌及CTB、LPS和類脂A、胞壁酰二肽等；細胞因子及熱休克蛋白 用于人體的佐劑：氫氧化鋁、明礬、poly IC、胞壁酰二肽、細胞因子、熱休克蛋白。常用于動物實驗的佐劑：弗氏佐劑(Fre

3、unds adjuvant) （二）常用佐劑的種類和制備半抗原免疫原的制備4 化合物:氫氧化鋁、明礬、礦物油、吐溫-80、弗氏不完1.氫氧化鋁佐劑：5%硫酸鋁5%氫氧化鈉氫氧化鋁沉淀制成懸液即為佐劑強烈攪拌NS洗二次NS等體積抗原免疫接種半抗原免疫原的制備51.氫氧化鋁佐劑：5%硫酸鋁5%氫氧化鈉氫氧化鋁沉淀制成懸液 2.明礬佐劑10%硫酸鉀鋁氫氧化鈉校正pH值至6.5沉淀乳狀懸液* 明礬佐劑抗原常用用于肌肉注射，皮下注射易引起肉芽種和膿腫。NS攪拌NS洗二次離心抗原備用防腐劑半抗原免疫原的制備6 2.明礬佐劑10%硫酸鉀鋁氫氧化鈉校弗氏佐劑（Freunds adjuvant）,分為弗氏不完全

4、佐劑和完全佐劑兩種：前者是由油劑（礦物油或花生油）和乳化劑（羊毛脂或吐溫-80）按1：11：5比例混合而成；后者由弗氏不完全佐劑加卡介苗組成。在免疫動物時，先將弗氏佐劑與抗原等比混勻，制成“油包水”乳化液。 3.弗氏佐劑(Freund adjuvant)半抗原免疫原的制備7 3.弗氏佐劑(Freund adjuvan作用大于不完全佐劑局部形成肉芽種和潰瘍不能用于人體弗氏完全佐劑液體石蠟完全乳化備用高壓滅菌加熱抗原弗氏不完全佐劑卡介苗羊毛脂鑒定一滴乳劑乳劑不散浮于液面水中混合半抗原免疫原的制備8作用大于不完全佐劑弗氏完全佐劑液體石蠟完全乳化備用高壓加熱目的:增強抗原對機體的免疫原性； 改變抗原的

5、分布； ； 為制備出高效價的免疫血清； 增強可溶性抗原的免疫原性； 在某種情況下，改變Ag免疫應答類型； 延長抗原在免疫動物的時間； 增強局部對變應原的超敏反情況；佐劑應用原則和評價半抗原免疫原的制備9目的:增強抗原對機體的免疫原性；佐劑應用原則和評價半抗原免 佐劑常混有微量其它物質，這些物質進 入體內后也可引起抗體的產主，影響抗 血清的特異性；應用佐劑的缺點 注射佐劑可引起局部形成肉芽腫和無菌 性膿腫； 反復注射，易發生超敏反應，使局部組 織壞死，甚至引起動物死亡。半抗原免疫原的制備10 佐劑常混有微量其它物質，這些物質進應用佐劑的缺點 注射多克隆抗體（polyclonal antibodi

6、es,pAb）：第一代抗體，是指由多克隆B細胞群產生的、針對多種抗原決定簇的混合抗體。單克隆抗體（monoclonal antibodies,mAb）：第二代抗體，是指由一個B雜交瘤細胞活化、增殖、分化產生的子代細胞克隆分泌的、針對一個抗原決定簇的抗體。基因工程抗體（genetically engineering antibodies）：第三代抗體。第二節 抗體的制備 半抗原免疫原的制備11多克隆抗體（polyclonal antibodies,pA半抗原免疫原的制備12半抗原免疫原的制備12 抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動物，該動物在含有多種抗原表位的抗原刺

7、激下，體內多個B細胞克隆被激活并產生針對某一抗原多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體 多克隆抗體（抗血清）的制備半抗原免疫原的制備13 抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種免疫血清的制備1.免疫動物選擇2.免疫方法3.動物采血法4.免疫血清的分離及保存 半抗原免疫原的制備14免疫血清的制備1.免疫動物選擇半抗原免疫原的制備14能作免疫接種用的動物主要是哺乳類和禽類。兔、綿羊、豚鼠、雞、山羊和馬。1.抗原與免疫動物種屬差異越遠越好。2.動物必須適齡、健壯、無感染。3.動物體內有與抗原相類似的物質或其它原因而使該抗原對該動物免疫原性極差，則該動物不能選用。例如：IgE綿羊，胰島

8、素-家兔，酶類-山羊等。4.抗血清的用量5.抗血清的要求：例如，馬型抗血清用于沉淀反應時較難掌握，因而極少應用。一、免疫動物選擇半抗原免疫原的制備15能作免疫接種用的動物主要是哺乳類和禽類。兔、綿羊、豚鼠、雞、常用的免疫動物兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于較大批量地生產抗體（商品）。馬（horse）：常用于大批量生產治療用抗體（商品）。豚鼠（guinea pig）：酶類免疫常用。

9、半抗原免疫原的制備16常用的免疫動物兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，抗體量 3.免疫方案 全量免疫法：弗氏佐劑抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐劑1月 抗原 混合免疫法：綜合皮下、淋巴結和靜脈二、免疫方法 1.免疫原的注射劑量 大:0.51mg/只，小:0.10.6mg/只 2.免疫途徑：免疫反應產生速度依次為靜脈 腹腔肌肉皮下皮內淋巴結足掌半抗原免疫原的制備17 3.免疫方案二、免疫方法 1.免疫原的注射劑量 大:0免疫間隔時間第一次和第二次間隔1020天，三次及以后間隔710天；半抗原免疫原的制備18免疫間隔時間半抗原免疫原的制備18采集免疫血清前，要預先測試抗體效價測定，

10、若效價達到要求，應在末次免疫后一周及時采血，否則抗體效價會下降。 (1) 頸動脈采血法; 最常用的方法，家兔、山羊等動物 ；(2) 心臟采血法; 用于豚鼠、大鼠、雞等小動物，要求操作熟練，(3) 靜脈采血法;家兔可用耳中央靜脈，山羊可用頸靜脈； 1、 收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。2、 56 30min滅活在無菌條件，吸出血清，分裝（0.050.2ml）；三、動物采血法半抗原免疫原的制備19采集免疫血清前，要預先測試抗體效價測定，若效價達到要1、 收1.4保存：可保存36個月2.低溫保存：-20-40，可保存23年3.

11、冰凍干燥保存：可保存35年四、免疫血清的分離和保存半抗原免疫原的制備201.4保存：可保存36個月四、免疫血清的分離和保存半抗原第三節 抗體的純化與鑒定 抗原免疫動物制備的抗血清是成分復雜的混合物，除含有特異性抗體外，還存在與目的抗體不相關的成分。純化目的是除去這些不相關成分，防止抗血清中其他雜抗體干擾試驗結果。半抗原免疫原的制備21第三節 抗體的純化與鑒定 抗原免疫動物制備的抗血清是成一、免疫球蛋白（抗體）的種類半抗原免疫原的制備22一、免疫球蛋白（抗體）的種類半抗原免疫原的制備22半抗原免疫原的制備23半抗原免疫原的制備23高變區（hypervariable region, HVR）互補性

12、決定區（complementarity-determining region, CDR）獨特型決定簇（idiotypic determinants）骨架區（framework region, FR）半抗原免疫原的制備24高變區（hypervariable region, HVR）抗體的功能半抗原免疫原的制備25抗體的功能半抗原免疫原的制備25二、抗體的純化方法鹽析法（硫酸銨沉淀)辛酸-硫酸銨沉淀法離子交換法親和層析法凝膠過濾法半抗原免疫原的制備26二、抗體的純化方法鹽析法（硫酸銨沉淀)半抗原免疫原的制備261、鹽析法（硫酸銨沉淀)原理在高濃度中性鹽存在下，蛋白質在水中的溶解度降低而產生沉淀；硫

13、酸銨是最常用的中性鹽; 不同蛋白質的鹽析常數不同; 硫酸銨的加入量通常以飽和度表示; (100%飽和度:767g/L)半抗原免疫原的制備271、鹽析法（硫酸銨沉淀)原理半抗原免疫原的制備27主要步驟在血清或腹水中加入硫酸銨使抗體沉淀；4高速離心,棄上清,溶解沉淀； 可反復操作,逐級降低硫酸銨的濃度: 50%飽和度: 0.313g/ml 45%飽和度: 0.277g/ml 40%飽和度: 0.243g/ml最后一次離心后,用少量PBS溶解沉淀,透析,測定濃度。半抗原免疫原的制備28主要步驟半抗原免疫原的制備28特點成本低，步驟簡單。抗體的回收率比較高。抗體純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶,不適

14、合于做各種標記。需要高速離心機。半抗原免疫原的制備29特點半抗原免疫原的制備292、正辛酸-硫酸銨沉淀法原理兩步沉淀：先加正辛酸去雜蛋白: 正辛酸是一種有機酸,在酸性條件下(pH4.5)可使大分子的雜蛋白沉淀.后加硫酸銨使抗體沉淀;半抗原免疫原的制備302、正辛酸-硫酸銨沉淀法原理半抗原免疫原的制備30主要步驟：血清濾紙過濾去沉淀和脂質，濾液用4倍體積60mmo1/ L醋酸緩沖液(pH4.0)稀釋后，用Na0H調，PH值至4.5。逐滴加入辛酸(終濃度25u1/ml)，室溫h攪拌30分鐘后，以6000-8000r/min.離心30分鐘，收集上清液。上清液經濾紙過濾2次，將濾液與10*PBS(0.

15、lmol/L，pH7.4按10:1比例混合，調pH至7.4,置冰浴冷至40度。每毫升上述混合液加0.2778固體硫酸錢，40度攪拌30分鐘，以4000-6000r/min離心巧一20分鐘，將沉淀溶于少量YBS，透析，測蛋白含量，凍存。半抗原免疫原的制備31主要步驟：半抗原免疫原的制備31特點成本較低，步驟較復雜。抗體回收率很低。抗體純度高，電泳后雜帶很少，適合于各種標記。需要高速離心機，耐高速離心的玻璃離心管。半抗原免疫原的制備32特點半抗原免疫原的制備323、離子交換法原理利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質分離.DEAE是一種陰離子交換劑，自身帶正電荷 (Diethy

16、laminoethyl,二乙氨基乙基)將樣品的pH值調至等電點以上,使樣品帶負電荷.采用鹽溶液洗脫,通過高濃度的帶同種電荷的離子(Cl-)置換被分離的組分. 半抗原免疫原的制備333、離子交換法原理半抗原免疫原的制備33+ - - - - - - - - 帶負電荷 的被吸附上帶負電荷少的先被置換帶負電荷多的后被置換半抗原免疫原的制備34+ 帶負電荷帶負電荷少帶負電荷多半抗原免疫原的制 NaCl Tris 梯度混合儀 連續梯度洗脫:半抗原免疫原的制備35 NaCl Tris連續梯度洗脫:半抗原免 階段洗脫:T離子強度蛋白濃度T倒入一定濃度的NaCl溶液通過離心來分離半抗原免疫原的制備36 階段洗

17、脫:T離子強度蛋白濃度T倒入一定濃度的Na主要步驟 先用硫酸銨沉淀抗體，粗提；將樣品過柱；洗去沒有結合的物質；用梯度NaCl溶液洗脫，等量收集洗脫液；紫外分光光度計測量，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度。半抗原免疫原的制備37主要步驟 半抗原免疫原的制備37圖3 在DEAE-纖維素上人血清蛋白的層析示意圖 (M=IgM, G=IgG, A=IgA) 半抗原免疫原的制備38圖3 在DEAE-纖維素上人血清蛋白的層析示意圖半抗原免疫原特點成本較低，步驟較簡單。抗體回收率較高。抗體純度較高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要冷柜，自動收集器。半

18、抗原免疫原的制備39特點半抗原免疫原的制備394、親和層析法原理利用蛋白質之間的特異性結合 （抗體-抗原，受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結合,捕捉與它相配的物質。洗脫一般采用改變pH值的方法半抗原免疫原的制備404、親和層析法原理半抗原免疫原的制備40使用前樣品結合(Binding)洗脫(Elution)半抗原免疫原的制備41使用前樣品結合(Binding)洗脫(Elution)半抗原主要步驟 將Protein A與活化的柱子相結合(買商品柱)；將腹水或血清處理后過柱；用結合緩沖液洗柱子，直到A280值為零；用甘氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液；測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升

19、高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度。半抗原免疫原的制備42主要步驟 半抗原免疫原的制備42葡萄球菌A蛋白 (staphylococcal protein A,SPA)金黃色葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白分子量42000,等電點pH5.1可與大多數動物Ig的Fc段結合一個SPA分子有4個相似的活性部位與IgG的結合最強,與IgM, IgA的結合較差 半抗原免疫原的制備43葡萄球菌A蛋白半抗原免疫原的制備43特點成本高，步驟較簡單。抗體回收率低。抗體純度高，適合于各種標記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要自動收集器。半抗原免疫原的制備44特點半抗原免疫原的制備445、凝膠過濾法(分子篩)原理將樣品混合

20、物通過一定孔徑的凝膠介質,由于流經路徑的差異,使不同分子質量的組分分離.大分子物質直接從凝膠顆粒外通過，走得快；小 分子物質進入凝膠顆粒的內部再出來，走得慢。適合于IgM類抗體的純化 (五聚體,分子量約800KD)半抗原免疫原的制備455、凝膠過濾法(分子篩)原理半抗原免疫原的制備45半抗原免疫原的制備46半抗原免疫原的制備46主要步驟將腹水或血清處理后上柱,樣品要濃； (可用G-200，柱子要長，80-100cm)待樣品入柱后,用緩沖液過柱；等量收集洗脫液,測定洗脫液的A280值。收集第一峰。半抗原免疫原的制備47主要步驟半抗原免疫原的制備47凝膠過濾法純化抗體血清蛋白的分級分離常用凝膠過濾

21、法進行，按分子大小可分為三組：第一組包括IgM和一些脂蛋白；第二組主要是IgG和較少量的IgA、IgD、IgE等球蛋白；第三組主要白蛋白、血清粘蛋白、鐵傳遞蛋白等。半抗原免疫原的制備48凝膠過濾法純化抗體血清蛋白的分級分離常用凝膠過濾法進行，按分 在凝膠過濾柱上血清蛋白的層析示意圖 (M=IgM, G=IgG, A=IgA) 半抗原免疫原的制備49 在特點成本高，步驟較簡單。抗體回收率較高，分離條件緩和，抗體活性不受影響。抗體純度較高。需要自動收集器。半抗原免疫原的制備50特點半抗原免疫原的制備50 1.抗體效價的鑒定：即為抗體活性滴定二、特異性抗體的鑒定 2.抗體特異性鑒定： 細菌類抗原的抗

22、體用凝集試驗 可溶性抗原的抗體用雙向瓊脂擴散試驗 3.抗體的純度鑒定：免疫電泳分析法 4.抗體親和力鑒定：親和力高則靈敏度好半抗原免疫原的制備51 1.抗體效價的鑒定：即為抗體活性滴定二、特異性抗體的鑒定單克隆抗體：由B細胞雜交瘤產生的只識別抗原 分子上一種抗原決定簇的抗體分子。一、雜交瘤技術的原理及流程二、單克隆抗體的應用多克隆抗體：識別抗原分子上各種抗原決定簇 的多種抗體的混合制劑。四、單克隆抗體技術半抗原免疫原的制備52單克隆抗體：由B細胞雜交瘤產生的只識別抗原一、雜交瘤技術的原 是指無性繁殖細胞系，是由單一個祖先細胞分裂繁殖而形成的一簇細胞純系。在這個家族的所有成員中，如無突變發生，其

23、基因是完全相同的。 克隆(clone)半抗原免疫原的制備53 是指無性繁殖細胞系，是由單一個祖先細胞分裂繁 克隆選擇學說的模式圖半抗原免疫原的制備54 克隆選擇學說。B 淋巴細胞半抗原免疫原的制備55。B 淋巴細胞半抗原免疫原的制備55McAb and PcAb半抗原免疫原的制備56McAb and PcAb半抗原免疫原的制備56流程半抗原免疫原的制備57流半抗原免疫原的制備57 一、雜交瘤技術的原理及流程半抗原免疫原的制備58 一、雜交瘤技術的原理及流程半抗原免疫原的制備58McAb的特點：高度特異性高度的均一性和可重復性 弱凝集反應和不呈現沉淀反應對環境敏感性優點 ：在體外“永久”地存活并

24、傳代，可用相對不純的抗原制備；局限性 ：制備技術復雜、費時費工、價格較高；二、單克隆抗體的特性半抗原免疫原的制備59McAb的特點：二、單克隆抗體的特性半抗原免疫原的制備591.醫學檢驗試劑： 傳染病的快速診斷 尋找TSA及檢測TAA 免疫細胞抗原檢測 激素測定 血中藥物濃度監測 HLA分型監測三、單克隆抗體的應用2.導向治療作用3.抗原物質的分離和提純半抗原免疫原的制備601.醫學檢驗試劑：三、單克隆抗體的應用2.導向治療作用半抗原The end半抗原免疫原的制備61The end半抗原免疫原的制備61 載體類型 1.蛋白質：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白等。載體

25、類型2.多肽聚合物：人工合成的，常見的有多聚賴 氨酸，其分子量大（可達十幾萬到幾十萬)， 這種多聚物和半抗原結合后，可刺激免疫動 物產生高效價、高親和力的抗體。3.大聚合物：羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可與半抗原結合，加入弗氏完全佐劑亦 可誘發動物產生抗體。半抗原免疫原的制備62 載體類型 1.蛋白質：人血清白蛋白、牛 半抗原-載體連接方法1碳化二亞胺法：半抗原載體連接方法1R-NH=CH-R半抗原載體蛋白質攪拌12h室溫24h透吸除去未反應的半抗原人工免疫原混合半抗原免疫原的制備63 半抗原-載體連接方法1碳化二亞胺法：半抗混合戊二醛法:半抗原-NH2載體蛋白-NH2半抗原-N=CH-

26、(CH2)3-CH=NH-載體蛋白OHC-(CH2)3-CHO*戊二醛是常用的帶有兩個活性基團的雙 功能聯接劑半抗原載體連接方法2半抗原免疫原的制備64混合戊二醛法:半抗原-NH2載體蛋白-NH2半抗原-N=CH氯甲酸異丁脂法：半抗原-COOH載體蛋白-NH2Cl-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-CO-NH-載體蛋白半抗原載體連接方法3簡便，用于類固醇抗原制備HO-CH2CH(CH3)2半抗原免疫原的制備65氯甲酸異丁脂法：半抗原-COOH載體蛋白-NH2Cl-COO琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制備半抗原-CH2OHCH2-CO CH

27、2-CO 帶羧基的半抗原琥珀酸衍生物半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH吡啶再經氯甲酸異丁脂法或碳化二亞胺法制備載體半抗原半抗原載體連接方法4半抗原免疫原的制備66琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制備半抗原-CH2OHC動物細胞融合技術B 、BB 、B瘤 、瘤瘤 、瘤只有雜種細胞才能活動物細胞培養2.單克隆抗體制備過程獲得產生相應抗體的B淋巴細胞半抗原免疫原的制備67動物細胞融合技術B 、BB 、B瘤 、瘤瘤 、瘤只有雜種細胞圖1 頸動脈分離圖 半抗原免疫原的制備68圖1 頸動脈分離圖 半抗原免疫原的制備68抗體效價的鑒定抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。（1）放

28、射免疫法（RIA）： 以不同稀釋度的抗血清與優質標記抗原混合，孵育后，測定其結合率。通常以結合率為50%的血清稀度和為效價。（2）雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。半抗原免疫原的制備69抗體效價的鑒定抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量放射免疫分析儀 瓊脂擴散實驗半抗原免疫原的制備70放射免疫分析儀 瓊脂擴散實驗半抗原免疫原的制備70特異性測定: 抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應的抗原及近似的抗原物質的識別能力，特異性好就是抗血清的識別能力強。抗體特異性通常是以交叉反應率來表示的, 交叉反應率低,

29、 表示抗血清的特異性好, 反之則特異性差。交叉反應率一般是用競爭抑制曲線來判斷的, 以不同濃度的抗原和近似抗原物質分別做競爭抑制曲線，計算各自的結合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應率。S= y/Z 100%S：交叉反應率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質的濃度。抗體特異性鑒定半抗原免疫原的制備71特異性測定: 抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應的抗原半抗原免疫原的制備72半抗原免疫原的制備72抗體親和力抗體親合力：在免疫學中， 親合力是指抗體與結合抗原體的活度或牢固度，單一抗體與單一抗原間的結合力, 是兩者間吸力及斥力的總合.

30、抗體與抗原結合疏松，結合后會迅速解離，稱為親合力低；反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結合位點與抗原的決定基之間的立體結構型的合適程度決定的。親合力常以親合常數K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達到的最小檢出量（靈敏度）的倒數，K=1/H，H是最小檢出量，通常，K的范圍在1081012L/mol之間，也有高達1014L/mol的。 半抗原免疫原的制備73抗體親和力抗體親合力：在免疫學中， 親合力是指抗體與結合抗原抗體親和力的測定方法競爭ELISA法；Biocore法：生物大分子相互作用儀 Biocore半抗原免疫原的制備74抗體親和力的

31、測定方法競爭ELISA法；Biocore半抗原免半抗原免疫原的制備75半抗原免疫原的制備75半抗原免疫原的制備76半抗原免疫原的制備76 動 物：BALB/c小鼠712周齡20g25g體重動物免疫半抗原免疫原的制備77 動 物：動物免疫半抗原免疫原的制備77細胞性抗原：（12）107/只，不加佐劑，23周重復一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加強免疫免疫方法半抗原免疫原的制備78細胞性抗原：免疫方法半抗原免疫原的制備78B淋巴細胞的分離免疫脾細胞的制備：1108的淋巴細胞 無菌手術制備；半抗原免疫原的制備79B淋巴細胞的分離免疫脾細胞的

32、制備：半抗原免疫原的制備79常用的小鼠骨髓瘤細胞株為SP20、NS1；不產生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細胞的動物品系相同骨髓瘤細胞半抗原免疫原的制備80常用的小鼠骨髓瘤細胞株為SP20、NS1；骨髓瘤細胞半抗原免半抗原免疫原的制備81半抗原免疫原的制備81培養骨髓瘤細胞選擇對數生長期的細胞進行傳代培養,細胞形態：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細胞返祖：定期用8-氮鳥嘌呤 （8-AG）處理細胞。注意事項：切忌過多傳代培養，可將細胞分裝凍存于-80或液氮及干冰中半抗原免疫原的制備82培養骨髓瘤細胞半抗原免疫原的制備82細胞融合劑：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的細胞融

33、合劑；作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合；作用特點：隨機發生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同；常用培養液：RPM1640或DMEM培養液；細胞融合半抗原免疫原的制備83細胞融合劑：細胞融合半抗原免疫原的制備83骨髓瘤細胞與B細胞(1:3)50% PEG 1min內加完;2min內加10ml培養液細胞融合半抗原免疫原的制備84骨髓瘤細胞與B細胞(1:3)細胞融合半抗原免疫原的制備84。飼養細胞半抗原免疫原的制備85。飼養細胞半抗原免疫原的制備85半抗原免疫原的制備培訓課件半抗原免疫原的制備87半抗原免疫原的制備87HAT選擇作用：淋巴細胞：不能生長，57天死亡；骨髓瘤細胞：不能生長，57天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷;HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻半抗原免疫原的制備88HAT選擇作用：半抗原免疫原的制備88雜交瘤細胞：從淋巴細胞獲得產生某種抗體的遺傳信息；從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力；利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA, 可長期生長繁殖； 半抗原免疫原的制備89雜交瘤細胞：半抗原免疫原的制備89有限稀釋法(limiting dilution) 顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescence activ