1、多房棘球絳蟲混合重組BCG【關鍵詞】多房棘球絳蟲；重組BGInhibitinnapptsisfsplenytesinieiunizedithixedrBGE/3andrBGE1433vaineagainstEhinusultilularis【Abstrat】AI:TiunizeieithixedrBGE/3andrBGE1433vaineagainstEhinusultilularis(E)andtinvestigatetheapptsisfspleenellshallengedithEprtslees.ETHDS:Balb/ieerevainatedsubutaneuslyandintran

2、asallyithixedrBGvainesrespetively.EighteeneeksafterhallengedithEprtsleestheieerekilledttakethespleen.Thespleenellsereislatedteasureappttiratebyflytetry.Blankvetr,BGandPBSservedasntrls.RESULTS:AppttirateintheiunizatingrupaslerthanthatinthePBSntrlgrup(P0.01).NLUSIN:Apptsisfspleenellsinieaybeinduedbyin

3、fetinithalvelarhydatidyst,butitanbeinhibitedbyiunizatinithixedrBGE/3andrBGE1433vaine.【Keyrds】Ehinusultilularis;rBGEII/3vaine;rBGE1433vaine;spleen/ytlgy;apptsis【摘要】目的：多房棘球絳蟲混合重組BGE/3和BGE1433疫苗免疫小鼠并以E原頭節攻擊后討論以上疫苗對小鼠脾細胞凋亡的變化.方法：將混合重組BG疫苗采用皮下注射和鼻腔內接種分別免疫Balb/鼠8k后，用多房棘球絳蟲原頭節進展攻擊感染，感染18k殺鼠取脾并別離脾細胞，流式細胞儀檢測

4、脾細胞的凋亡發生率，同時設有空載體、BG和PBS對照.結果：疫苗接種組的脾細胞凋亡發生率明顯低于感染對照組.結論：泡球蚴感染可引起小鼠脾細胞凋亡，而多房棘球絳蟲混合重組BGE/3和BGE1433疫苗可在一定程度上抑制感染鼠脾細胞的凋亡.【關鍵詞】多房棘球絳蟲；重組BGE/3疫苗；重組BGE1433疫苗；脾/細胞學；細胞凋亡0引言Aeisen等1認為某些寄生蟲感染誘導的凋亡在疾病的發病機制中起重要作用.人們發現小鼠感染惡性瘧原蟲(Plasdiufaliparu)或日本血吸蟲(shistsajapniu)以及大鼠感染卡氏肺孢子蟲(pneuystisarinii)后均可誘導其脾細胞發生凋亡2-4.泡

5、型包蟲病(alvelarehinsis,AE)是由多房棘球絳蟲(Ehinusultilularis,E)的中絳期幼蟲寄生在人體肝臟引起的一種嚴重危害人類安康的人畜共患寄生蟲病.當前分子生物學技術的開展為研制理想的E疫苗提供了新方法，將E外源DNA引入特定疫苗載體構建重組活疫苗可將保護性抗原傳遞至宿主免疫系統.王昌源等5發現E/3重組抗原ELP蛋白是一種有較好保護性免疫力的抗原分子.SilesLuas等6證實E1433抗原位于E原頭蚴的生發層，其過度表達與原頭蚴的進展性、侵入性和無限制生長特性有關，提示它是一種有希望的疫苗分子.irill等7認為卡介苗BaillealetteGuerin,BG是

6、一種理想的疫苗載體.atsu等8在BG中成功構建了外源抗原分泌系統，這為開展BG成為多價疫苗載體打下了堅實的根底.本實驗我們在成功構建重組BGE/3和BGE1433疫苗的根底上9-10，等量混合以上兩種疫苗作為混合疫苗免疫小鼠,原頭節攻擊免疫鼠并觀察其脾細胞凋亡的情況，從而為研究該疫苗的保護性免疫機制提供有價值的實驗數據.1材料和方法1.1材料65只雌性Balb/小鼠，1214周齡，體質量2025g，購自重慶醫科大學實驗動物中心；多房棘球絳蟲重組BGE/3和BGE1433疫苗由本室構建9-10，將rBGE/3和rBGE1433疫苗按11的濃度比例混勻，組成混合疫苗；nA購自Siga公司.Ann

7、exinVFIT試劑盒(LHK601100)購自深圳晶美生物工程公司.1.2方法1.2.1實驗分組65只雌性Balb/小鼠隨機分為5組，每組13只.第1組為5106fu混合疫苗懸浮于100LPBS于小鼠后背部皮下單次注射；第2組為5105fu疫苗懸浮于10LPBS于小鼠鼻腔黏膜單次接種；第3組為5106fu的空載體含pBG質粒的BG皮下單次注射對照組；第4組為5106fu的BG皮下單次注射對照組；第5組為100LPBS皮下單次注射對照.1.2.2攻擊感染多房棘球絳蟲混合重組BGE/3和重組BGE1433疫苗免疫8k后用50個泡球蚴原頭節腹腔內注射進展攻擊.對照組的攻擊方案同免疫組.1.2.3脾

8、細胞制備攻擊感染后18k剖殺各組小鼠，750L/L乙醇消毒、無菌取脾臟、勻漿、200目尼龍網過濾；滅菌雙蒸水溶解紅細胞后，用含100L/L滅活小牛血清的RPI1640培養液調整細胞濃度為5109/L，并參加青霉素1105U/L和鏈霉素1105U/L；臺盼藍染色后發現脾細胞存活率為93%97%.1.2.4脾細胞培養將別離的小鼠脾細胞參加24孔細胞培養板，每個標本設2孔，分別參加原液、10g/LnA各1L,3750L/L2培養1216h.1.2.5AnnexinVFIT染色法檢測小鼠脾細胞凋亡培養1216h后，搜集5109/L脾細胞，用4預冷的PBS洗細胞兩次，2500r/in離心5in；用250

9、L結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度至1109/L；取100L的細胞懸浮液參加5L流式細胞管中，參加AnnexinVFIT5L和20g/L碘化丙錠溶液10L；混勻后室溫避光孵育15in；在反響管中加400LPBS，用流式細胞儀(美國BetnDikinsn公司)記錄FIT標記的凋亡細胞在波長為495n紫外光激發下產生525n的綠色熒光以及PI標記的凋亡細胞和壞死細胞在波長為340n的紫外光激發下產生620n的紅色熒光，用ellQuest軟件分析細胞凋亡.統計學處理：各免疫組小鼠脾細胞凋亡發生率采用SPSS11.0軟件進展分析，計量資料采用xs表示，組間比擬采用方差分析，組間兩兩比擬用SNK法.2

10、結果2.1原液組脾細胞凋亡當脾細胞不用任何刺激物時，5106fu混合rBG疫苗皮下注射免疫小鼠后，脾細胞凋亡發生率與PBS對照組相比降低P0.01；5105fu混合疫苗鼻腔內接種免疫小鼠后，脾細胞凋亡發生率低于PBS對照組P0.01；皮下注射組的脾細胞凋亡發生率與鼻腔內接種組相比差異無統計學意義P0.05；空載體和BG皮下注射組的脾細胞凋亡發生率分別與PBS對照組相比無統計學差異P0.05，表1.表1重組BGE/3和BGE1433疫苗免疫，原頭節攻擊后小鼠脾細胞凋亡檢測略2.2nA刺激組脾細胞凋亡變化當脾細胞用nA刺激培養時，皮下注射組和鼻腔內接種組的脾細胞凋亡發生率低于PBS對照組P0.01

11、；鼻腔內接種組的脾細胞凋亡發生率低于皮下注射組P0.01；空載體和BG皮下注射組的脾細胞凋亡發生率分別與PBS對照組相比差異無統計學意義P0.05，表1.3討論碘化丙啶(prpidiuidide,PI)是一種DNA染料，可特異性與DNA結合，但其不能透過細胞膜.由于凋亡細胞的膜通透性增加，因此可著染PI.當用熒光激活細胞分檢器flureseneativatedellsrter,FAS檢測時，著染PI的凋亡細胞在一定壓力下，通過殼液包圍的進樣管進入流動室，排成單列細胞，經流動室的噴嘴噴出形成細胞液流.在波長為340n紫外光激發下產生波長為620n的紅色熒光信號，經過計算機處理形成熒光直方圖.凋亡

12、細胞信號出現于亞G1蜂上，但只代表G0/G1期發生凋亡的細胞，而不能檢測S期和G2期發生凋亡的細胞；在單細胞懸液制備過程中，易產生大量細胞碎片，晚期凋亡細胞經洗滌處理可引起胞內DNA喪失，造成亞G1峰前移，與碎片峰交融在一起，因此不能區分凋亡細胞和碎片；同時壞死細胞也可著染PI，因此也不能區分凋亡細胞和壞死細胞.AnnexinVFIT染色法可彌補PI染色法的缺乏，早期凋亡細胞因細胞膜的磷脂對稱性改變而使磷脂酰絲氨酸phsphatidylserine,PS暴露于細胞外，PS可特異結合標記有異硫氰酸熒光素(fluresEinisthiyanate,FIT)的連接素VannexinV；標記FIT的凋

13、亡細胞在波長為495n紫外光激發下產生525n的綠色熒光，標記PI的凋亡細胞和壞死細胞在波長為340n的紫外光激發下產生620n的紅色熒光，經過計算機處理形成DNA二維圖.可見AnnexinVFIT染色法不僅可以區分凋亡細胞綠色與壞死細胞紅色，而且可檢測DNA含量紅色，因此AnnexinVFIT染色法是研究細胞凋亡的一種較理想方法.李富榮等11將正常Balb/鼠脾D4+T淋巴細胞用EAg刺激培養16h后，用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(terinaldexynuletidyltranseferaseediateddUTPnikendlabeling,TUNEL)檢測其凋亡發

14、生率為0.92%，而小鼠感染泡球蚴12k和25k時凋亡發生率為4.29%和34.72%.本實驗結果顯示小鼠感染泡球蚴18k時，用AnnexinVFIT染色法檢測脾細胞凋亡發生率為16.92%21.35%，類似上述結果，提示泡球蚴感染可誘導小鼠脾細胞發生凋亡，推測泡球蚴抗原經抗原提呈細胞加工處理后，形成1317個氨基酸殘基組成的抗原肽，該肽與H分子連接形成抗原肽H分子復合物，經高爾基體運送到AP外表，與小鼠脾細胞TR/D3復合物結合后，誘導胞內Fas/Ap1/D95及其配體FasL表達，導致脾細胞凋亡12，此過程稱激活誘導的凋亡ativatininduedelldeath,AID.Kreer等1

15、3證實BG接種可抑制人外周血單核細胞發生凋亡.本文發現BG和空載體皮下注射組小鼠脾細胞凋亡發生率細微低于感染對照組，說明BG免疫對泡球蚴感染鼠脾細胞凋亡具有一定的抑制作用.本實驗結果顯示皮下注射組和鼻腔內接種組小鼠脾細胞凋亡發生率顯著低于感染對照組，提示疫苗接種可抑制泡球蚴感染鼠脾細胞發生凋亡，推測混合重組BGE/3和BGE1433疫苗免疫小鼠后可激活體內的免疫細胞，促進其分泌免疫效應分子，這些免疫細胞與免疫效應分子互相促進和互相調節，抑制泡球蚴感染鼠脾細胞發生凋亡，使小鼠脾細胞數目相對增加，從而加強小鼠抗泡球蚴感染的保護性免疫反響.【參考文獻】1AeisenJ,EstaquierJ,Idzi

16、rekT.FrAIDStparasiteinfetin:pathgenediatedsubversinfprgraedelldeathasaehanisfriunedysregulatinJ.IunlRev,1994,142(1):9-51.2TureBaldeASarthuJL,AribtG,etal.PlasdiufaliparuinduesapptsisinhuannnulearellsJ.InfetIun,1996,64(3):744-750.3李文桂,石佑恩.血吸蟲重組BGSj26GST疫苗免疫對D4+T細胞凋亡的影響J.中國免疫學雜志,2000,16(專刊):10-13.4李文桂,

17、陳雅棠,劉成偉.雙氫青蒿素對卡氏肺孢子蟲肺炎大鼠脾細胞凋亡的影響J.中國人獸共患病雜志,2022,19(2):55-59.5王昌源,陳雅棠,余登高,等.多房棘球絳蟲ELP重組蛋白疫苗免疫Balb/小鼠引起的免疫應答J.免疫學雜志,2022,19(4):285-288,292.6SilesLuas,FelleisenRS,HephillA,etal.Stagespeifiexpressinfthe1433geneinEhinusultilulrisJ.lBiheParasitl,1998,91(2):281-293.7irillJD,StverK,BlBR,etal.Baterialvainev

18、etrsandbaillusaletteGuerinJ.linInfetDis,1995,20(4):1001-1009.8atsuK,YaaguhiR,YaazakiA,etal.EstablishentfafreignantigenseretinsysteinybateriaJ.InfetIun,1990,58(12):4049-4054.9李文桂,王鴻,朱佑明.多房棘球絳蟲重組BGEII/3疫苗構建及其表達效率J.中國地方病學雜志,2022,25(5):490-493.10王鴻,李文桂.多房棘球絳蟲重組BGE1433II/3疫苗的構建及鑒定J.中國病原生物學雜志,2022,1(1):43-46.11李富榮,石佑