1、治療性血管新生實驗研究的假設干進展金 惠 銘復旦大學上海醫學院生理與病理生理學系 上海 200032，中國治療性血管新生實驗研究的假設干進展治療性血管新生的概念及現況血管新生旁觀分子對內皮細胞增殖的影響生長因子對內皮細胞遷移的雙相調節三. 內皮細胞生長因子受體活性的動態變化四. 血管內皮祖細胞 治療性血管新生的 概念及現況Therapeutic Angiogenesis治療性血管新生 將外源性血管新生誘導因子導入缺血組織，增強缺血區毛細血管新生，從而加速側枝循環的形成。 主要用于治療缺血性(心血管)疾病。Folkman, J 肌肉注射 局部灌注A.V.滴注 滲透泵心腔外注入 病毒載體介導 局部

2、注射 基因埋線 基因治療 脂質介導 球囊導管導入 轉化細胞包被應用 質粒DNA介導 冠脈內支架 蛋白治療VEGF治療細胞治療治療性血管新生常用的方法細胞鋪路Cellular Spreading分子搭橋Molecular Bridging Folkman JFrom the lab to the clinic: one investigators journeyJ Law, Medicine & Ethics 2002, 30(3): 361366從實驗室到臨床:一位科學家的旅行一.血管新生旁觀分子對內皮細胞增殖的影響Bystander molecules(血管新生) 旁觀分子COX-2，PGE

3、2，Integrins，etc.bEnd.3 (200 )經典途徑bFGF-induced proliferation of bEnd.3 (MTT) -actinEffect of bFGF on COX-2 protein expression in bEnd.3 (Western Blot)COX-2 0 4 8 16 32 Time(h) 0 0.5 2.5 5 10 15 bFGF(ng/ml)Control bFGFEffect of bFGF(10ng/ml) on COX2 protein expression in bEnd.3 (8h,ABCmethod,400X) GAP

4、DH COX-1 COX-20 1 2 3 6 12 Time(h) 0 0.5 2.5 5 10 15 bFGF(ng/ml)Effect of bFGF on COX mRNA expression in bEnd.3 (RT-PCR) bFGF-induced PGE2 secretion of bEnd.3 & effect of COX-2 inhibitor on it (ELISA)Effects of COX-2 inhibitor and PGE2R antagonist on bFGF-induced VEGF secretion in bEnd.3bFGFEC增殖VEGF

5、COX-2PGE2bFGF引起EC多途徑增殖經典途徑 旁路 途 徑 信號轉換bFGF非特異性 EC特異性VEGF二.生長因子對內皮細胞遷移的雙相調節EC劃痕損傷模型EC scratch wound model 研究: 細胞遷移 ( cell migration) Dynamic changes of cell migration induced by bFGF in cultured bEnd.3 Left: bFGF (5g/L) Center: control Right: bFGF (15 g/L)0h24h48h內皮細胞體外劃痕損傷模型中bFGF對細胞遷移的影響Focal Adhesi

6、on Kinase粘著斑激酶FAKFAKNBand 4.1Kinase DomainFGFCPhosphorylation FAK Tyr-397F.A.TY397Activitied FAKPGrowth Factor Receptor PTKsPro-1Pro-2FAKRasRafMEKERKCrkSOSSrcPaxillinCASGrb2PWAVE/ScarDOCK180RacPakASAGRAFMigrationGTPaseFAK含量051015(g/L)bFGF對血管內皮細胞中FAK含量的影響 (Western Blot, 12h)bFGF*P0.05*FAK活性 051015(g/

7、ml)bFGF對血管內皮細胞中FAK活性的影響 (12h)* P0.050h6h12h510bp(FAK)510bp(FAK)510bp(FAK)450bp(GAPDH)450bp(GAPDH)450bp(GAPDH)og./L bFGF 2. 5g/L 3. 10g/L 4. 15g/L bFGF對FAK mRNA表達的影響(RT-PCR)內皮細胞生長因子受體活性的動態變化三.VEGF受體(Flk-1)在心肌梗死大鼠心肌微血管內皮細胞上的表達 (免疫組化，ABC法 400)A. 梗死區 B. 梗死邊緣 C. 非梗死區 D. 對照心肌ABCDExpression changes of bFGF

8、R1 after rat acute myocardial infarction (Real-time RT-PCR, n=5)*#*#*#*#*#*#*/GEArrayTM Q series Mouse Angiogenesis Gene Array小鼠血管新生基因芯片(Super Array, U.S.A.)非梗死區邊緣區心肌梗死大鼠心肌細胞內血管新生基因表達的變化 (Micro-array)心肌梗死大鼠心肌微血管內皮細胞血管新生誘導因子受體基因表達的變化 (1W)PositionGenebankGene nameControlExperiment14NM_010109Ephrin A r

9、eceptor1.474E-12.170E-217NM_007912EGFR-0.000E-1-0.000E-129M33760FGFR10.004E-12.773E-430M81342FGFR38.731E-39.014E-431NM_008011FGFR42.816E+03.077E+033X59397Flk-1/KDR1.199E+01.049E+034L07297Flt-1-0.000E-12.773E-359NM_011058pDGFR-0.000E-12.982E-360NM_008809pDGFR-0.000E-15.055E-276D13738Tie-2-0.000E-19.0

10、14E-481D28526TGFR1-0.000E-10.000E+082NM_009371TGFR22.834E-11.907E-2四.血管內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cell)磁性活化細胞分選系統Magnetic activated Cell-sorting system (MACS) MicroBeads: 50nm 用MACS 別離臍血中CD133+ 細胞模式圖經磁珠別離的CD133+細胞培養14d后細胞外表分子標志CD133流式細胞儀鑒定結果 (A:0d B:14d)ABDecrease of cell markers CD133, CD34 on ad

11、herent cells and increase of Flk-1 in the presence of VEGF, bFGF and SCF after 14 days of culture (P0.05).干細胞血管內皮祖細胞造血干細胞內皮祖細胞，內皮細胞，造血干細胞循環CD34+內皮祖細胞，內皮細胞CD34+, Flk-1+內皮祖細胞CD34+, Flk-1+,AC133 +培養內皮細胞CD34+, Flk-1+,AC133本課題受國家“十五“211工程重點學科建設基金資 助參加本課題的研究人員樂 飛 張國平 王新紅 梁光波 張 威 史連國 曲曉義 錢睿哲Thanks！Thanks！Angiogenesis inducible factors: VEGF etc. To stimulate prol