1、檸檬酸搖瓶發酵及提取第1頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四實驗目的：1、學習掌握檸檬酸液體發酵工藝2、了解檸檬酸提取工藝3、增強團隊協作能力第2頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四檸檬酸：C6H8O7物化性質：白色結晶粉末，無臭。 熔點(), 153 。味極酸，在潮濕的空氣中微有潮解性。它可以以無水合物或者一水合物的形式存在：檸檬酸從熱水中結晶時，生成無水合物；在冷水中結晶則生成一水合物。加熱到78 時一水合物會分解得到無水合物。加熱至175 C時它會分解產生二氧化碳和水，剩余一些白色晶體。所以，檸檬酸提取過程中，溫度控制很重要。分子式：實驗原理高度親

2、水性第3頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四實驗原理檸檬酸發酵為典型的有機酸發酵，淀粉質原料經淀粉酶作用水解為葡萄糖，葡萄糖經EMP途徑氧化為丙酮酸，丙酮酸進一步被氧化脫羥生成乙酰CoA，就一般能量代謝過程而言，生成的乙酰CoA與草酰乙酸縮合成檸檬酸后進入三羥酸循環，通過三羥酸循環進行有氧呼吸的能量代謝。但就檸檬酸產生菌（黑曲霉菌）而言，在實驗pH下，其順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶活性很低，而檸檬酸合成酶的活性很高，因而大量積累檸檬酸。第4頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四檸檬酸的發酵的過程80%的糖代謝走EMP途徑黑曲霉中存在TCA的酶系第5頁，共22

3、頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四檸檬酸發酵的條件1、合適的碳源（淀粉、麥芽糖、甘露糖等），高濃度的糖；2、合適的pH值，黑曲霉在pH為23的環境中發酵糖，產物以檸檬酸為主；當pH接近中性時則大量產生草酸， 而檸檬酸產量很低； 3、發酵液中溶氧量要高（搖床的轉速200r/min）。第6頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四生產菌種：黑曲霉 Aspergillus niger半知菌亞門，絲胞綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬。真菌中的一個常見種。生長適溫37，最低相對濕度為88%檸檬酸產量最高的菌種。且能利用多樣化的碳源。生產方法： 深層液體發酵法發酵周期短，產率高，節省

4、勞動力，占地面積小，便于實現儀表控制和連續化 第7頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四 實驗流程 斜面 發酵培養基 接種補糖4d ,28提取（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基）（搖床）（每48h補一次）第8頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四2C6H8O7H2O + 3CaCO3 Ca3(C6H5O7)24H2O + 3CO2 + H2O 中和終點pH:6.06.8溫度：5070菌液過濾中和酸解 過濾脫色去金屬離子濃縮結晶Ca3(C6H5O7)24H2O + 3H2SO4 + 4H2O 2C6H8O7H2O + 3CaSO42H2O ，85在此溫度下各種變體石膏的

5、溶解度均最?。?，并有利于形成片狀 的半水石膏，便于過濾加熱至8090加熱的作用：終止發酵；使蛋白變性凝固，降低發酵液黏度；使菌體中的檸檬酸釋放活性炭，13%，85，攪拌30min強酸型陽離子交換樹脂 5060，常壓濃縮易分解成烏頭酸，且結晶色澤變深提 取 工 藝 流 程第9頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四1、菌種：黑曲霉 Aspergillus niger2、培養基： PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂 )培養基,發酵培養基(土豆 200g 煮汁、 蔗糖20g、NH4NO3 2g，KCl 0.15g，MgSO4 0.25g，水1000ml；pH=5 )3、器材：三角瓶2個，棉塞2

6、個，紗布若干，接種環，小燒杯，水浴加熱鍋，離心機，離心管，PH試紙，電子天平，濾紙，大試管, 電爐（加石棉網）, 搖床, 玻璃棒，無菌tip頭，移液槍，堿式滴定管，電子顯微鏡4、試劑：無菌水，酚酞，0.14290.1430 mol/L NaOH溶液，CaCO3， 10% H2SO4， 40%蔗糖溶液實驗器材第10頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四實驗步驟2、發酵培養基配制及分裝 （以實驗室為單位） 配方：土豆 200g 煮汁、 蔗糖20g、NH4NO3 2g，KCl 0.15g，MgSO4 0.25g，水1000ml；pH5 （總糖100 g/L；基礎 20 g/L +補

7、糖 80 g/L ）分裝：每小組2瓶，每瓶100ml；棉塞或8層紗布；0.08Mpa，20min 第11頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四3、制備孢子懸液及接種 （以小組為單位） 向每支斜面菌種加入5ml無菌水，用接種環刮菌苔表面或用無菌tip頭輕輕吹打制備孢子懸液；將懸液接入滅菌并冷卻至室溫的培養基。 注：勿接入過多孢子，否則菌絲過于濃密，影響產酸和后處理中的過濾第12頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四4、搖瓶發酵、補料及參數檢測 搖瓶條件：200rpm，32；發酵4天補料：發酵48h補糖，每瓶（100ml）加入滅菌40%蔗糖液27ml。參數檢測：

8、接種后每24h取樣測定、記錄發酵液pH。 第13頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四5、發酵液酸度測定 酸度 是指100ml發酵液所含檸檬酸的克數。酸度測定方法： 取發酵液濾液或離心液1ml，以酚酞為指示劑，用0.14290.1430mol/L標準NaOH溶液滴定至淡粉紅色，所消耗的NaOH毫升數即為發酵液酸度。 （通過對檸檬酸酸度的測定，可以推出從葡萄糖到檸檬酸的轉換率。）第14頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四6、檸檬酸提?。ú糠郑?1） 2C6H8O7H2O + 3CaCO3 Ca3(C6H5O7)24H2O + 3CO2 + H2O 2） Ca

9、3(C6H5O7)24H2O + 3H2SO4 + 4H2O 2C6H8O7H2O +3CaSO42H2O 3）濃縮結晶 C6H8O7H2O 分子量 210.14CaCO3 分子量100.1 Ca3(C6H5O7)24H2O 分子量 570.50 硫酸 分子量98，比重1.84 1g 檸檬酸0.714g 碳酸鈣1.357g 檸檬酸鈣0.7g 濃硫酸 = 0.38ml 濃硫酸 = 3.8ml 10% 硫酸檸檬酸的產量可以根據酸度值算出中和酸解第15頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四菌絲過濾 發酵液經24層紗布過濾（如需要可再用濾紙過濾一次）或經離心（菌絲球很小的過濾太慢）取

10、濾液； 測量濾液體積； 將發酵液倒于小燒杯，置70水浴加熱。第16頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四中 和 根據酸度測定結果計算出濾液中所含檸檬酸克數，并計算出與檸檬酸反應所需的CaCO3的量；稱取CaCO3，慢慢將CaCO3加入發酵液中，輕輕搖動燒杯，反應至不再有氣泡產生， pH6.06.5。 用濾紙過濾，得白色檸檬酸鈣；檸檬酸鈣結晶呈成簇的針狀。 如果發現所得結晶有雜色（如發黃），可將檸檬酸鈣結晶從濾紙上刮至小燒杯，加適量水，洗后再次過濾。 第17頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四酸解 將檸檬酸鈣結晶從濾紙上刮至小燒杯，加適量水調成“糊”，將小燒

11、杯放85水浴中加熱。 根據計算，向小燒杯中慢慢加入所需10% H2SO4 ，邊加邊輕輕搖動燒杯，使反應進行徹底。 過濾，將濾液收集到大試管（過濾時可將試管插在試管架上），濾液即為檸檬酸溶液，用于下一步濃縮結晶。 濾紙上的白色物為硫酸鈣結晶，顯微鏡下呈片狀或針狀。第18頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四濃縮與結晶 將大試管中的檸檬酸液倒入小燒杯，置電爐（加石棉網）上加熱，煮沸濃縮。 待觀察到濃縮液中有少許白色晶體出現（此時已為過飽和，濃縮液易向外噴濺），即可停止加熱，令濃縮液冷卻；在冷卻過程中，檸檬酸逐漸從濃縮液中結晶析出。 濾紙過濾，得檸檬酸結晶；檸檬酸結晶顯微鏡下呈針狀

12、。第19頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四準備1、 發酵培養基2、補料用40%蔗糖溶液 配制200ml，分裝于2個250ml三角瓶3、標定用NaOH標準溶液 配制200ml，裝藍蓋瓶4、酚酞指示劑 0.1g溶于250ml 70%90%酒精，裝藍蓋瓶第20頁，共22頁，2022年，5月20日，4點59分，星期四計算檸檬酸發酵的轉化率，即每100克葡萄糖經轉化所能生成的檸檬酸克數，檸檬酸發酵的理論轉化率按下列反應計算應為106.7%?？偡磻剑?C6H12O6+3O22C6H8O7+4H2O實驗結果1、觀察孢子萌發、菌絲球的生長情況（進行拍照）2、接種后每24h取樣測定、記錄發酵液pH值3、發酵4天后取樣測定酸度（計算后面要用的CaCO3以及H2SO4用量）4、中和后照下檸檬酸鈣照片，酸解后照下硫酸鈣照片5、濃縮結晶后照下檸檬酸鈣照片6、通過檸檬酸酸度計算檸檬酸發