1、各類干細胞應用特點研究比較徐瑞權干細胞研究的重要性： 美國Science雜志1999年將“干細胞研究的新發現”列入十大科技進展之首2000年再次入選年度十大科技進展2002年列入值得關注的六大科技領域之一至今干細胞各領域的研究飛速發展美國加州每年提供干細胞研究經費達3億美元 我國有關干細胞的研究也十分活躍，已有多個有關干細胞的“973”項目，召開過多次全國性或國際性學術會議，出版過多本專（譯）著。“863”計劃近期將為干細胞研究提供2億元人民幣的經費。干細胞治療的特點1.一次性介入，永久性治療； 2.不需要完全了解疾病發生的確切機理； 3.可應用于自身干細胞移植，避免產生免疫排斥反應。干細胞應

2、用的基礎調控 干細胞的調控是指給出適當的因子條件，對干細胞的增值和分化進行調控，使之向指定的方向發展。包括：內源性調控外源性調控內源性調控 干細胞自身有許多調控因子可對外界信號起反應從而調節其增殖和分化：（1）細胞內蛋白對干細胞分裂的調控：在果蠅卵巢中，調控干細胞不對稱分裂的是一種稱為收縮體的細胞器，包含有許多調節蛋白，如膜收縮蛋白和細胞周期素A。收縮體與紡錘體的結合決定了干細胞分裂的部位，從而把維持干細胞性狀所必需的成分保留在子代干細胞中。 （2）轉錄因子的調控在胚胎干細胞的發生中，轉錄因子Oct4是必需的。Oct4是一種哺乳動物早期胚胎細胞表達的轉錄因子，它誘導表達的靶基因產物是FGF-4

3、等生長因子，能夠通過生長因子的旁分泌作用調節干細胞以及周圍滋養層的進一步分化。Oct4缺失突變的胚胎只能發育到囊胚期，其內部細胞不能發育成內層細胞團白血病抑制因子（LIF） Tcf/Lef轉錄因子 外源性調控干細胞的分化還可受到其周圍組織及細胞外基質等外源性因素的影響 （1）分泌因子間質細胞能夠分泌許多因子，維持干細胞的增殖，分化和存活.有兩類因子在不同組織甚至不同種屬中都發揮重要作用，它們是TGF家族和Wnt信號通路。 干細胞的分化還可受到其周圍組織及細胞外基質等外源性因素的影響 （1）膜蛋白介導的細胞間的相互作用 有些信號是通過細胞-細胞的直接接觸起作用的。-Catenin就是一種介導細胞

4、粘附連接的結構成分。穿膜蛋白Notch及其配體Delta或Jagged也對干細胞分化有重要影響. 干細胞的分化還可受到其周圍組織及細胞外基質等外源性因素的影響 （3）整合素（Integrin）與細胞外基質 整合素家族是介導干細胞與細胞外基質粘附的最主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細胞的非分化增殖提供了適當的微環境。1整合素干細胞的分類及特點：胚胎干細胞成體干細胞誘導分化干細胞（iPS），可誘導分化為機體胚胎干細胞成體干細胞來自胚泡的內細胞群來源于骨髓、外周血、角膜、視網膜、腦、骨骼肌、齒髓、肝、皮膚、胃腸道粘膜層和胰腺等發育全能性，可誘導分化為機體分化較局限，部分成體干細胞（造血干細胞

5、、骨髓間充質干細胞、神經干細胞）有一定跨系、跨胚層的“可塑性”無限的自我更新能力病理條件下才顯出一定的自我更新潛能增殖能力強，便于應用增殖能力較弱，故不能完全取代胚胎干細胞細胞可不斷增殖，“永生化”，移植后有形成腫瘤的可能性成瘤的可能性很小不能自體移植自體移植可避免免疫排斥有倫理問題分離和使用不存在倫理問題胚胎干細胞 衍生自囊胚的內細胞團或原始外胚層的細胞；永生化(immortal)；能維持穩定的正常的二倍體染色體結構；有穩定的發育潛能，能被誘導增殖或分化；能參與胎兒所有組織的發育過程； 胚胎干細胞的性質胚胎干細胞系的建立過程ES細胞研究的趨勢改善ES細胞的體外培養條件，建立更有效更簡便的獲得

6、ES細胞的方法。定向誘導分化成特定類型細胞，用于臨床疾病的治療，并解決免疫排斥和潛在的致腫瘤的問題。成體干細胞的橫向分化的能力以及與胚胎干細胞的比較，成體干細胞能否替代胚胎干細胞？胚胎干細胞的特點增殖速度：1824h分裂增殖一次 hES必須在含有白血病抑止因子（LIF）的培養基及成纖維細胞飼養層(freeder cell)條件下才能保持繁殖而不分化。 hES體外培養要解決的關鍵問題是維持細胞的分裂增殖而抑止其分化。 具有分化形成外、中、內三個胚層的潛能。 能形成嵌合體動物，從而成為聯系細胞和個體之間的橋梁。鑒定： 人胚胎干細胞特異表面抗原的表達胚胎階段特異性抗原: SSEA-1 SSEA-3

7、SSEA-4 Thmoson分離的hES 陰性 弱陽性 強陽性Gearhart分離的hES 陽性 弱陽性 陽性小鼠ES 陰性 陰性 陽性鼠和人胚胎干細胞表達的表面抗原有種屬差異。 Gearhart等認為SSEA-1陽性可能是源于原始生殖細胞的多能干細胞分化的標志.細胞膜表面有特殊的標記：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81a 胚胎干細胞具有正常穩定的二倍體核型和帶型。 b 胚胎干細胞具有較高的端粒酶活性及堿性磷酸酶的表達。 人胚胎干細胞系端粒酶活性都很高，說明其可在體外未分化狀態進行長期培養。鑒定. 具有轉錄因子Oct-4的表達 Oct-4只限定在多潛能細胞中表

8、達。 人和小鼠的胚胎干細胞都表達轉錄因子Oct-4，當胚胎干細胞分化時，其表達能力大大降低。 Oct-4可能是哺乳動物不同發育階段多潛能細胞所特有的少數特異的調控分子之一。胚胎干細胞鑒別鑒別不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色能分化成三個胚層的細胞，將胚胎干細胞植入免疫缺陷小鼠皮下可產生畸胎瘤可誘導分化為各種成體干細胞注：人胚胎干細胞具有自我更新和多潛能的特性，以及以下一些特征： 1）可以從囊泡的內細胞團中分離出來；2）在體外的增殖力非常強；3）在繼代的培養過程中保持正常的多倍體核型；4）可以分化為三個胚層的細胞；5）具有端粒酶活性 內細胞群的細胞可以發育成除了胎盤以外

9、的完整個體，因而這些細胞被認為具有全能性。胚胎干細胞的優點 全能性1. ES細胞的全能性主要體現在以下幾方面： 形成畸胎瘤。將ES細胞注人同源動物皮下可形成畸胎瘤，包括三個胚層細胞； 形成類胚體。培養ES細胞在非粘附底物中懸浮生長，或控制增殖細胞數目。能夠使之生成類胚體，它是一個與畸胎瘤相似的多種系混雜的集合體、具有三個胚層組織； 直系分化。通過控制ES細胞生長環境，或遺傳操縱特定基因表達，ES細胞可直接分化成某特定種系細胞，例如將神經決定基因NeuroD2和NeuroD3轉人ES細胞，可使之分化為神經細胞； 形成嵌合體。將ES細胞注射到同種動物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），E

10、S細胞可以參與嵌合體各個器官包括生殖腺的發育。這是檢驗一個細胞系是否為ES細胞的標準。 ES細胞生物學特性細胞形態結構及核型細胞的高度分化潛能堿性磷酸酶的表達胚胎階段特異性細胞表面抗原的表達 1. 各種動物的ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態結構，胞體體積小，核大，有一個或幾個核仁。 2. ES細胞與卵圓柱期（egg cylinder stage）胚胎外胚層和胎兒生殖峙的原始生殖細胞類似，而與 ICM細胞有差異。 3. 細胞中多為常染色質，胞質結構簡單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了整倍體性質。正常ES細胞染色體正常，如發生異常則其很難發育分化形成動物個體。 4. ES細胞在體外

11、分化抑制培養中，呈克隆狀生長，細胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細胞界限不清，克隆周圍有時可見單個ES細胞和分化的扁平狀上皮細胞。 5. ES細胞增殖迅速，每1824 h分裂增殖 1次。 6. 此外，其還可以在體外進行選擇、操作、凍存。凍存的細胞可在需要時隨時解凍，繼續培養不失其原有特性，并且來自一個克隆的細胞具有同樣的特征。1、ES細胞形態結構及核型 2、ES細胞的高度分化潛能 ES細胞的全能性是其區別于成纖維細胞等體細胞的顯著特點1. ES細胞在體外需在飼養層細胞上培養才能維持其未分化狀態，一旦脫離飼養層就自發地進行分化。2. 在單層培養時細胞自發分化成多種細胞， 懸浮培養中： “簡單類胚體

12、” “囊狀胚體” 細胞分化物。3. ES細胞可進行誘導分化 *用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導90以上的ES細胞分化為神經膠質細胞。 *聚集培養的ES細胞誘導分化則可分化為有節律性收縮的心肌細胞。 *將ES細胞注射到同源動物皮下，可形成組織瘤，其細胞組成可代表3個胚層細胞。 *用ES細胞作核供體進行細胞核移植，可以得到可發育重構胚和動物個體。 3.堿性磷酸酶的表達 許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細胞和囊胚細胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達，小鼠的EC細胞和ES細胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細胞和ES細胞中AKP呈弱陽性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。因此，AKP常用

13、來作為鑒定EC細胞或ES細胞分化與否的標志之一。4、胚胎階段特異性細胞表面抗原的表達 早期胚胎細胞表面均表達胚胎階段特異性表面抗原（SSEA1）。在胚胎的原始外胚層細胞、ES細胞、EC細胞和原始生殖細胞的表面均可檢測到SSEA1的表達。小鼠SSEA1的表達自8一細胞期開始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細胞全部呈強陽性，晚期囊胚中部分ICM呈強陽性，部分呈弱陽性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細胞鑒定的一個標志。ES細胞的應用前景（1）ES細胞在動物克隆及人類治療性克隆中的應用（2）在轉基因動物中的應用 （3）制備嵌合體動物ES研究面臨的難題 1、體外培養ES 細胞應當是既能快

14、速無限增殖，又呈未分化狀態。如何平衡這一對矛盾, 必須篩選適宜的培養條件。目前在ES細胞研究中存在著建系成功率也不高等問題, 只在小鼠中建立了穩定的ES細胞系，家畜、人類細胞系建立的最佳條件仍無定論。 2、ES 細胞高度未分化, 具有形成畸胎瘤的可能性, 因此在使用ES 細胞進行治療前必須首先體外誘導ES 細胞分化產生某種特異的組織細胞或設計自殺基因, 當移植的細胞向腫瘤發展時, 自殺基因能啟動自毀機制使其凋亡。但如何誘導ES細胞定向分化成單一類型的分化細胞, 是至今仍未解決的難題。因此，必須尋找各種細胞定向誘導分化的條件和方法，以及不同干細胞的表面標志和分選技術，從而得到所需要的細胞或組織。

15、 3、ES細胞真正用于器官克隆與移植仍需要技術上的突破，因為器官的形成是一個非常復雜的三維過程, 很多器官是兩個不同胚層的組織相互作用而形成的。即便是發育完整的來自自然機體的器官, 要離體培養并維持其正常的生理功能目前還無法做到, 器官的體外保存和維持仍是器官移植中的難題。 4、最大的障礙來自于倫理學問題，特別是ES細胞應用受到倫理、法律、宗教以及社會因素的強烈反對，有些國家甚至明令禁止進行人類ES細胞研究。無論從基礎研究角度來講還是從臨床應用方面來看，人類ES細胞帶給人類的益處遠遠大于在倫理方面可能造成的負面影響，但隨著觀念的改變，人們會逐漸認識到ES細胞對臨床醫學及生物學理論研究的重要作用

16、。 WASHINGTON The US National Institutes of Health (NIH) could provide funding for research on human embryonic stem cells as early as the spring if new guidelines, published by the NIH last week after widespread public consultation, are formally approved. Nature 402, 566 (1999)TOKYO Japans cloning ba

17、n will still allow stem cell experiments Nature 404, 321 (2000)LONDON European panel rejects creation of human embryos for research Nature 408, 277 (2000)倫理學問題：Stem cell research quidlineDEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICESPublic Health ServiceNational Institutes of HealthNational Institutes of H

18、ealth Guidelines for Research Using Human Pluripotent Stem Cells SUMMARY: The National Institutes of Health (NIH) is hereby publishing final National Institutes of Health Guidelines for Research Using Human Pluripotent Stem Cells. The Guidelines establish procedures to help ensure that NIH-funded re

19、search in this area is conducted in an ethical and legal manner. 另外，利用胚胎干細胞進行克隆性治療在目前尚受到多方面的限制胚胎干細胞誘導分化的條件及分化成熟的鑒定標準尚不成熟，人們對如何避免分化不完全的胚胎干細胞在體內導致畸胎瘤的危險性仍不清楚人ESC用于臨床的疾病治療短期內將難以實現解決胚胎來源有限的途徑： 未成熟卵的體外成熟（1）Knock-out 胚胎干細胞的組織相 容性抗原（2）Knock-in 受者的組織相容性抗原（3）與同一來源的造血干細胞一同移植（4）受者的體細胞核移植避免免疫排斥的方法分離、純化：隨著對胚胎干細胞

20、研究的進展，分離、純化技術得到較好的解決。倫理學問題的解決：誘導產生多能性干細胞（IPS）的研究，充分解決了胚胎干細胞所面臨的倫理學問題。誘導產生多能性干細胞的研究細胞重編程的研究概況核移植：核移植試驗最初是在兩棲動物中實現的，通過將體細胞核注入到去核卵母細胞中，但具有很大的局限性。將成熟的體細胞與多潛能的細胞（ES細胞、胚胎癌細胞等）融合，或者用胚胎干細胞提取物來處理體細胞，也可以在一定程度上使體細胞發生重編程。但面臨許多倫理學問題。 有沒有相對簡單，又可擺脫材料來源和倫理學諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？2006年11月20日，日本京都大學的山中伸彌（Shinya Yam

21、anaka)和美國威斯康星大學的詹姆斯湯姆森（James Thomson）分別在細胞和科學雜志上發表重量級論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類體細胞改造成了類胚胎干細胞，在功能上幾乎可以和胚胎干細胞相媲美。誘導產生多能性干細胞：幾個轉錄因子導入已分化的細胞，進而獲得了類似于胚胎干細胞的多能性干細胞，稱之為“誘導產生的多功能性干細胞”（induced pluripotent stem cells,iPS細胞）。方法：借助“逆轉錄酶病毒”為載體,即向皮膚細胞中植入一組4個基因 (Oct4,Sox2,c-myc和Klf4 )，通過基因重新編排，使皮膚細胞具備胚胎干細胞的功能。這種被改造過的細胞稱作

22、“iPS細胞”。優越性：1、利用iPS細胞作為實驗模型，只操縱幾個因子的表達，加速對多能性調控機理的深入研究。2、獲得的方法相對簡單穩定，不涉及胚胎的破壞，無倫理道德限制。3、對于疾病機理研究和新藥開發等方面將有很大貢獻。4、可望制造特定病人來源的iPS細胞，用“個性化”移植來治療諸多疾病。iPS細胞檢測-hES 標記表現Sell-specific surface antigens (Adewumi et al., 2007)iPS細胞檢測-hES 標記表現stage-specific embryonic antigen-1(SSEA-1)Ips細胞研究中存在的問題1、腫瘤相關基因，如c-my

23、c的使用，有誘發癌癥的可能。2、逆轉錄病毒轉染可能會導致一些癌基因的激活，也可能導致某些重要基因功能受阻。3、基因表達模式與ESC還存在一些不同。4、效率較低，重組率只有0.1%。存在的問題IPS細胞與hES細胞的DNA分析結果顯示兩者之間仍有差異存在.效率不高：1/5103 cells挑選出的細胞群落參雜有HDF反轉錄病毒隨機插入而抑制相關基因一些沒有被核型分析檢測到的基因改變反轉錄病毒隨機插入可能會誘發癌癥iPS細胞形成畸胎瘤內胚層中胚層中胚層外胚層外胚層中胚層iPS細胞形成畸胎瘤In vivo：將iPS細胞胞注射至嚴重免疫缺陷綜合癥(SCID)小鼠的背側皮下。九周后：產生腫瘤組織學檢測：

24、腫瘤中含有各式各樣的組織Teratoma：畸胎瘤包含有器官或是組織的腫瘤，類似三個胚層的衍生物。IPS細胞插入基因檢測PCR顯示每個中都有插入四個逆轉錄病毒IPS細胞非污染的產物免疫印跡分析，以c-Myc cDNA為探針 由逆轉錄病毒的c-Myc內生性的c-MycIPS細胞與hES細胞的DNA分析結果顯示兩者之間仍有差異存在效率不高：1/5103 cells 挑選出的細胞群落參雜有HDF 反轉錄病毒隨機插入而抑制相關基因 一些沒有被核型分析檢測到的基因改變反轉錄病毒隨機插入可能會誘發癌癥成體干細胞是存在于成體動物的許多組織和器官，具有修復和再生的能力的細胞。成體干細胞大多數時候處于靜息狀態。在

25、特定條件下，成體干細胞或者產生新的干細胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態平衡。 成體干細胞 （adult stem cell，ASC）各類成體干細胞： 干細胞名稱Stem cell niche干細胞標志分化細胞標志分化促進因子神經祖細胞神經干細胞側腦室室管膜細胞巢素蛋白CD133微管結合蛋白-2神經膠質原纖維酸性蛋白GFAP表皮生長因子成纖維細胞生長因子表皮干細胞毛囊干細胞基底細胞角蛋白15K5、K14Wnt腸干細胞腸腺基部及近基部K8、 K18、 K19肝干細胞Hering管門管區膽管周圍卵圓細胞：OV-6、c-kit、CD34、AFP小肝細胞：

26、間充質干細胞骨髓竇的內腔面SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD99、CD106、CD124、CD120a、多種組織標志（如骨形態發生蛋白受體-BMPR）多種誘導因素造血干細胞骨髓、臍帶血、外周血成體干細胞的優點 成體干細胞則可從患者自身獲得，不存在組織相容性的問題。 成體干細胞不會誘發畸胎瘤的發生。 成體干細胞也不存在倫理學爭執。成體干細胞的不足尚未從人體的全部組織中分離出成體干細胞 .成體干細胞含量極微，很難分離和純化，且數量隨年齡增長而降低 在一些遺傳缺陷疾病中，遺傳錯誤很可能也會出現于病人的干細胞中，這樣的干細胞不適于移植 成人身上獲得的干細胞可能沒有年輕人的干細胞那樣的增

27、殖能力 由于日常生活中人是暴露在各種環境之下，日光和毒素等都有可能造成基因突變，成體干細胞可能包含更多的DNA異常。沒有證據表明成體干細胞是多能干細胞 成體干細胞稀少，難以識別與純化，也難以在培養條件下在未分化狀態保持長時間增殖，或能夠保持長時間增殖時，又不定向分化。 骨髓間充質干細胞（Mesenchymal stem cells, MSC） 骨髓間充質干細胞，是骨髓中除造血細胞以外的中胚層來源的細胞，其細胞特性穩定，在連續傳代培養和凍存后仍具有多向分化潛能。是干細胞的一種，具有干細胞的共性，即自我更新及多向分化的能力。最初是由Alexander Friedenstein發現，且證明其在體外分

28、化成為硬骨骼及脂肪細胞，后續有其他的研究團隊發現，此類干細胞更可以分化成為肝臟、軟骨、肌肉等組織細胞， 2002 年一月由美國明尼蘇達大學 (University of Minnestoa) 研究人員發表的成果，發現 更可以分化成為神經系統的細胞。在特定的誘導條件下，骨髓間充質干細胞可以分化為間充質組織中的各類細胞，包括：骨、軟骨、脂肪、肌腱、韌帶等細胞。骨髓間充質干細胞：特點可經誘導向軟骨細胞分化，并能分泌特異性型膠原基質，因此可望成為工程化軟骨的種子細胞；分化為肌細胞，可能成為肌萎縮、肌營養不良時促進肌組織再生的靶細胞； 與基因治療結合，可強化治療效果，對某些基因突變所致的遺傳性疾病；可分

29、離其自體的間充質干細胞，體外進行改造，敲除突變基因，導入正常基因，然后重新輸入體內，既糾正了遺傳缺陷，又避免發生移植反應。 原代培養15天的人骨髓間充質干細胞 （4倍）人骨髓間充質干細胞傳代后經過14天誘導分化形成的成骨細胞堿性磷酸酶陽性呈紫紅色 40X人骨髓間充質干細胞傳代后經過14天誘導分化形成的脂肪細胞紅油染色陽性 40XBMSCs優點：BMSCs易于提取、分體、純化及擴增，適合作基因治療的載體細胞。患者可以用自己的干細胞治療疾病，從而克服了移植排斥反應。另外，MSCs具有可植入性，在特定的條件下還可分化為骨、軟骨、肌肉等組織細胞，是多種疾病基因治療的理想種子細胞。另外，BMSCs具有極

30、強的自我復制能力和多向分化潛能，來源廣泛，易于獲取，且具有低免疫原性，應用方便。BMSCs缺點：BMSCs具有體外易衰老等缺點，BMSCs傳代至67代后細胞生長逐漸緩慢，呈現衰老現象，故細胞存在數量不足、體外擴增困難、體外傳代、保存及復蘇后增殖及分化能力下降等問題，嚴重影響其進一步廣泛研究及臨床應用。永生化骨髓間充質干細胞現BMSCs具有體外易衰老等缺點，通過基因工程方法，使BMSCs傳代次數的增加、仍可保持較好的活性，該類BMSCs稱為永生化骨髓間充質干細胞。細胞永生化機制： M1-M2 理論:細胞經多次分裂后,在腫瘤抑制因子p53 和Rb 作用下,細胞進入M1期,開始衰老。細胞經過2030

31、PDs后,進入M2 期凋亡,只有罕見的細胞在一些因素影響下,端粒酶被激活,以它自身RNA為模板不斷合成端粒DNA 來補充和延長端粒有限長度,以維持端粒長度,恢復染色體的穩定性使細胞得以逾越M2期,獲得無限分裂和增殖的能力, 發生永生化。Shay JW , Wright WE , Werbin H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization J . Biochim Biophys Acta ,1991 ,1072(1) :127.永生化BMSCs研究方法：通過質粒pCMVSV40TPUR導入大鼠BMSCs，建立永生化BMSCs在倒置顯微鏡下觀察細胞形態；采用檢測堿性磷酸酶的活性。采用裸鼠皮下接種實驗檢測細胞的致瘤性；永生化BMSCs特點：未導入質粒的BMSCs培養至l5代后細胞不能繼續傳代，呈明顯衰老跡象。而永生化BMSCs培養至15代后仍可保持較好的活性，永生化BMSCs隨著傳代次數的增加其形態未見明顯改變，細胞傳代至15代時，細胞增長速度無減慢趨勢永生化BMSCs具有明顯接觸抑制鏡下觀察發現永生化BMSCs細胞間仍存在接觸抑制，且通過裸鼠皮下注射永生化BMSCs后，觀察4wk后，未見瘤體的出現，表明細胞為良性細胞可能性大，且無明顯