1、免疫組織化學(xué)在皮膚腫瘤中的應(yīng)用吳潞明 定義： 又稱免疫細(xì)胞化學(xué)。它是組織化學(xué)的分支，為確定某一特定物質(zhì)在組織內(nèi)的局部定位，使用以目的物作為抗原的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法，即免疫組織化學(xué)(簡(jiǎn)稱免疫組化)。免疫組織化學(xué)概論（Immunohistochemistry）原理其主要原理是用熒光素、生物素或地高辛等標(biāo)記的抗體（或抗原）對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)，經(jīng)過(guò)組織化學(xué)的呈色反應(yīng)之后，用顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察。免疫組化的技術(shù)分類免疫組化的方法有直接法和間接法：直接法直接標(biāo)記特異性抗體；間接法不直接標(biāo)記特異性抗體，一般標(biāo)記免疫球蛋白，將被標(biāo)記的免疫球蛋白再結(jié)合

2、到特異性抗體上。免疫組化技術(shù)常用方法按標(biāo)記物種類可分為：免疫熒光法、免疫酶法、免疫金屬技術(shù)、親和免疫組化技術(shù)以及免疫電鏡技術(shù)等。常用標(biāo)記物熒光素：最常用的是異硫氰酸熒光素（FITC） 熒光顯微鏡下呈綠色熒光；四乙基羅達(dá)明（RB200）熒光顯微鏡下發(fā)橙紅色熒光；使用熒光顯微鏡觀察上述熒光標(biāo)記物（熒光抗體法）。辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素等：運(yùn)用普通光學(xué)顯微鏡觀察的標(biāo)記物。鐵蛋白金等：主要應(yīng)用于免疫電鏡。免疫組化在皮膚病理中的應(yīng)用凡是組織細(xì)胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì)，如肽類、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、受體、表面抗原、病原體等均可用免疫組織化學(xué)方法顯示。免疫組化在皮膚病理中的作用主要是鑒別組織類型或

3、細(xì)胞來(lái)源，在淋巴細(xì)胞增生疾病中，免疫組化可在其克隆方面提供信息，有助于判斷細(xì)胞的良惡性來(lái)源。親和免疫組織化學(xué)技術(shù)70年代以來(lái)，免疫組織化學(xué)在技術(shù)方法上不斷改進(jìn)，涌現(xiàn)了一批新的技術(shù)方法，其特點(diǎn)為一些具有雙價(jià)或多價(jià)結(jié)合力的物質(zhì)如植物凝集素（Lectin）、生物素（Biotin）、親和素（avidin）和葡萄球菌A蛋白（SPA）等被應(yīng)用于免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，從而建立了SPAHRP法、ABC法、BRAB法和LAB法等。其共同特點(diǎn)是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)，其本質(zhì)上又非抗原抗體反應(yīng)。因此，Bayer（1976）首次稱之為親合組織化學(xué)。事實(shí)上，抗原抗體反應(yīng)從本質(zhì)上也屬于親合組織化學(xué)這一范

4、疇。目前，親合組織化學(xué)包括抗原與抗體、植物凝集素和糖類、生物素與抗生物素、葡萄球菌A蛋白與IgG、陽(yáng)離子與陰離子、激素、維生素、糖及類脂質(zhì)作用部位和受體等。親合細(xì)胞化學(xué)引入免疫細(xì)胞化學(xué)后使其敏感性得到進(jìn)一步提高，因此更有利于微量抗原（或抗體）在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，從而出盡了免疫組化技術(shù)的發(fā)展和親和免疫組化的創(chuàng)立。親和素與生物素系統(tǒng)1、親和素 是一種堿性糖蛋白，分子量為68000，具有4個(gè)同維生素H親合力極高的結(jié)合點(diǎn)。一般從蛋白清中提取，故又稱卵白素。2、維生素H（以下統(tǒng)稱生物素） 是一種小分子的維生素，與卵白素之間有極強(qiáng)的親合力，較之抗體對(duì)抗原親合力要高出100萬(wàn)倍，能彼此牢固結(jié)合而不影響

5、彼此的生物學(xué)活性。注：生物素與卵白素都具有與其它示蹤物質(zhì)如熒光素、鐵蛋白和過(guò)氧化物酶等相結(jié)合的能力。利用上述特性，建立了卵白素生物素免疫染色系統(tǒng)，即親和素生物素免疫染色法。3、鏈霉親和素 是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量60000，且不含糖鏈。同親和素一樣，具有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，親和力高達(dá)10-15mol/L，是一種更完美的生物素結(jié)合蛋白。優(yōu)點(diǎn)：很少有低聚糖殘余成分，可保持中性等電點(diǎn)，避免了組織中的非特異性染色。借助此特點(diǎn)建立了親和素鏈霉免疫染色法。基本原理近年來(lái)，親和免疫組化技術(shù)不斷創(chuàng)新，目前為止擁有標(biāo)記親和素-生物素技術(shù)（LAB）、橋親和素-生物素技術(shù)（BAB）、親和素生物

6、素過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（ABC）以及鏈霉親和素生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（SP）等。1LAB法以生物素標(biāo)記抗體作第一抗體，過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素作為第二抗體（見圖）：BAB法把兩者連接起來(lái)先用生物素標(biāo)記的抗體與細(xì)胞/組織內(nèi)的抗原反應(yīng)，洗去未結(jié)合的抗體，加入抗生物素孵育后，洗去未結(jié)合的抗生物素，再加入已標(biāo)記酶的生物素孵育，洗片以細(xì)胞化學(xué)方法呈色反應(yīng)（見圖）。 ABC法（1）ABC復(fù)合物的制備：（2）ABC法反應(yīng)原理SP或SAP法即過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素或過(guò)氧化物酶標(biāo)記的堿性磷酸酶染色。反應(yīng)原理鏈霉SP或SAP法該法是ABC法基礎(chǔ)上的進(jìn)一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結(jié)合，而后再結(jié)合過(guò)氧化物酶

7、 。它有4個(gè)亞基可與生物素結(jié)合，靈敏特異，背景低，成本低。優(yōu)點(diǎn)：更簡(jiǎn)便，放大倍數(shù)，等電點(diǎn)中性更適合組織，分子量小，穿透力。（三）染色步驟（SP法為例）每份組織均切3m的薄片,于60烤箱烤片6h以上備用。具體步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化熱修復(fù)3% H2O2，室溫10滴加非免疫性動(dòng)物血清，室溫10滴加一抗，室溫60min或4過(guò)夜封片，鏡下觀察，保存水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS返藍(lán)鏡下觀察控制DAB顯色加鏈霉-過(guò)氧化物酶溶液室溫10-30加生物素-二抗，室溫孵育1030PBS沖洗3次3min PBS沖洗3次3min除去PBS液除去血清PBS沖洗3次3min除去PBS液PBS沖洗3次3min，除去P

8、BS液PBS沖洗3次3min除去PBS液人體常見細(xì)胞的免疫組化特性淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞自然殺傷細(xì)胞肥大細(xì)胞組織細(xì)胞皮膚、粘膜、軟組織器官間質(zhì)細(xì)胞間皮細(xì)胞骨髓 神經(jīng)來(lái)源細(xì)胞淋巴細(xì)胞B 細(xì)胞：CD45+;CD20+;CD45RA+ ; CD79a+ T 細(xì)胞： CD45+; CD3+; CD45RO+; CD43+; 多數(shù)TCR-, 有時(shí)TCR-; CD4+ /CD8+; T細(xì)胞亞群可表達(dá)細(xì)胞溶解因子(granzyme B, TIA1, perforin) 人體常見細(xì)胞的免疫組化特性漿細(xì)胞CD138+; CD45-/+; CD20-; CD79a+/-; Ig+; EMA+/- NK 細(xì)胞CD45+;

9、表面CD3-; 胞漿 CD3+; CD43+; CD45RO+; CD56+; CD57+/-; Granzyme B+; TIA1+; Perforin+人體常見細(xì)胞的免疫組化特性肥大細(xì)胞CD117+組織細(xì)胞CD45+; S100-; CD68+; CD1a-; lysozyme+; HLA-DR+; CD43+人體常見細(xì)胞的免疫組化特性皮膚、粘膜、軟組織器官1、上皮 CK+ (腺上皮傾向表達(dá)低分子量CK，有些上皮可表達(dá)特殊CK亞型); vimentin-/+; BerEP4+/-; EMA+/-; E-cadherin+/- 人體常見細(xì)胞的免疫組化特性2、特殊類型上皮細(xì)胞* 表皮：34E1

10、2+, CAM5.2-, CK5/6+ 基底層上方：CK1、CK10基底層：CK5、CK14* 腺上皮：CEA 可能+ (管腔面); EMA 通常+ ， CK8+人體常見細(xì)胞的免疫組化特性3、肌上皮 CK+; CK14+; 高分子量 CK+; Actin+; calponin+; S100-/+; GFAP-/+; Vimentin+ 4、黑素細(xì)胞 S100+; Vimentin+; CK-; c-kit+； HMB45- (交界區(qū)黑色素細(xì)胞可+); 人體常見細(xì)胞的免疫組化特性5、Merkel細(xì)胞：CK+; CK20+; NSE+; synaptophysin+; chromogranin+;

11、 neurofilament+ 6、 Langerhans細(xì)胞：CD45+; S100+; CD68-/+; CD1a+; lysozyme-/+; HLA-DR+ 7、基底膜：IV型膠原8、皮脂腺：EMA+;CEA-;低分子量CK（CAM5.2）-；S100-。人體常見細(xì)胞的免疫組化特性間質(zhì)細(xì)胞1、纖維母細(xì)胞 Vimentin+; Actin-; Desmin-; CK- 2、肌纖維母細(xì)胞 Vimentin+; Actin+; Desmin-/+; CK-/+ 3、平滑肌 Vimentin+; Actin+; Desmin+; CK-/+ 4、樹枝狀細(xì)胞 Vimentin+; CD34+;

12、Actin-/+; Desmin- 人體常見細(xì)胞的免疫組化特性5、內(nèi)皮細(xì)胞：第VIII 因子相關(guān)抗原+; CD31+; CD34+; Vimentin+ 6、血管周細(xì)胞：第VIII 因子相關(guān)抗原-; CD31-; CD34-; vimentin+; Actin+; Desmin- 7、脂肪細(xì)胞：Vimentin+; S-100+ 人體常見細(xì)胞的免疫組化特性8、軟骨細(xì)胞 Vimentin+; S100+; GFAP+/- 9、骨骼肌 Vimentin+; Actin+/-; Desmin+; Myoglobin+; MyoD1- (僅原始或胚胎肌細(xì)胞+); Myogenin- (僅原始或胚胎肌細(xì)

13、胞+); S100-/+ (弱陽(yáng)性); CD56-/+ (受損肌肉+) 人體常見細(xì)胞的免疫組化特性間皮細(xì)胞CK+; CK5/6+; Vimentin+; Calretinin+; HBME1+; N-cadherin+; E-cadherin-; CEA-; BerEP4-; LeuM1-; Desmin -/+ (occasional) 人體常見細(xì)胞的免疫組化特性常見皮膚病和性病的IHC標(biāo)記腫瘤標(biāo)記：上皮來(lái)源腫瘤、間葉來(lái)源腫瘤、造血干細(xì)胞來(lái)源腫瘤色素性疾病標(biāo)記其他標(biāo)記：銀屑病、扁平苔蘚、副銀屑病等常見皮膚腫瘤表皮腫瘤黑素細(xì)胞痣惡性黑素瘤皮膚淋巴增生性疾病及相關(guān)腫瘤皮膚附屬器腫瘤結(jié)締組織腫瘤表

14、皮腫瘤 基底細(xì)胞癌重要病理改變a 瘤體由基底樣細(xì)胞組成，核大，漿少，染色嗜堿，b 周邊細(xì)胞呈柵欄狀排列，腫瘤團(tuán)塊與周圍基質(zhì)間常有裂隙。基底細(xì)胞癌組織類型很多，如結(jié)節(jié)性、淺表性、色素性、透明細(xì)胞性、印戒細(xì)胞性、侵襲性、硬化性、角化性、多形性、腺樣、異型基底細(xì)胞癌、基底鱗狀細(xì)胞癌、向毛囊分化基底細(xì)胞癌、纖維上皮瘤型、向肌上皮、皮脂腺、大汗腺、小汗腺分化基底細(xì)胞癌。IHC標(biāo)記：CK8、Bcl-2等鑒別診斷：鱗癌(低分化)、毛發(fā)上皮瘤、毛源性腫瘤、毛囊漏斗腫瘤、汗管樣小汗腺癌、日光角化病等右圖：BCC表達(dá)CK8陽(yáng)性，CK10陰性左圖：BCC化生性BCC：梭形細(xì)胞表達(dá)結(jié)合蛋白，示其向平滑肌分化BCC伴有

15、導(dǎo)管分化：CEA表達(dá)陽(yáng)性Bowen病（原位鱗狀細(xì)胞癌）腫瘤細(xì)胞標(biāo)記如下：泛角蛋白+；EMA+；CAM5.2-；CEA-；S-100-，HMB-45-。鑒別診斷：淺表性基癌、光化性角化病、 Bowen病樣丘疹病、Paget病等。鱗狀細(xì)胞癌IHC：CK10、EMA、CAM5.2等多種亞型：透明細(xì)胞SCC、梭形細(xì)胞SCC、促結(jié)締組織增生性SCC、棘突松解型SCC、假血管性SCC、腺性SCC、疣狀癌、化生性皮膚癌（癌肉瘤）等。鑒別診斷：日光性角化病以及與各亞型相似的各種疾病等。高分化CK10陽(yáng)性低分化CK10陰性低分化CK8陰性黑素細(xì)胞痣分型：皮內(nèi)痣、交界痣和復(fù)合痣。IHC標(biāo)記：S-100等。鑒別診斷

16、：惡性黑素瘤HMB-45、Ki-67和Cyclin D1腫瘤細(xì)胞全層陽(yáng)性表達(dá)，而黑素細(xì)胞痣只有表淺的痣細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性；惡黑表達(dá)P53蛋白，而痣陰性。左：淺層細(xì)胞表達(dá)HMB-45，深層痣細(xì)胞不表達(dá)；中：只有一種或兩種痣細(xì)胞表達(dá)Ki-67；右：只有少量真皮淺層痣細(xì)胞表達(dá)CyclinD1 ，注意只有胞核著 色的細(xì)胞才是陽(yáng)性細(xì)胞。左圖：暈痣，多數(shù)為復(fù)合痣，可見色素失禁。右圖：隨著痣細(xì)胞的調(diào)亡，痣細(xì)胞越來(lái)越難鑒別，而被含色素的巨噬細(xì)胞所取代，殘余的痣細(xì)胞S-100染色陽(yáng)性可識(shí)別。Spitz痣又稱Spitz瘤、幼年黑素瘤和梭形上皮痣。IHC鑒別診斷：與惡性黑素瘤鑒別如下HMB-45Ki-67Cyclin D

17、1P53CD40CD44Spitz痣真皮淺表細(xì)胞+真皮淺表少量細(xì)胞+真皮內(nèi)隨深度增加陽(yáng)性率降低持續(xù)表達(dá)陽(yáng)性惡性黑素瘤真皮全層細(xì)胞+瘤細(xì)胞均+瘤體強(qiáng)表達(dá)許多結(jié)節(jié)性黑素瘤+40%惡黑+較Spitz痣表達(dá)水平低Spitz痣：復(fù)合痣隨深度增加的成熟現(xiàn)象Spitz痣：粉紅或紅棕色圓頂狀丘疹或結(jié)節(jié)惡性黑素瘤主要亞型：惡性雀斑樣黑素瘤、淺表擴(kuò)散性惡黑、肢端惡黑和結(jié)節(jié)性惡黑等。其它亞型：痣樣惡黑、小細(xì)胞黑素瘤、Spitz痣樣惡黑、印戒細(xì)胞黑素瘤、棒狀黑素瘤、透明細(xì)胞黑素瘤、粘液性黑素瘤、腺樣黑素瘤、惡性藍(lán)痣、結(jié)締組織增生性惡黑以及皮膚鱗狀惡黑等。惡性黑素瘤IHC標(biāo)記S-100：特異性較差；HMB-45：有助于

18、與普通痣鑒別。90%-100%原發(fā)惡黑和80%-86%轉(zhuǎn)移性惡黑陽(yáng)性表達(dá)，但梭形細(xì)胞型惡黑對(duì)其敏感性較差，且結(jié)締組織增生性惡黑多為陰性。Ki-67：有助于鑒別良性痣與惡黑，前者只有不到5%的細(xì)胞核陽(yáng)性，且位置表淺；后者25%的細(xì)胞陽(yáng)性。Bcl-2：在正常黑素細(xì)胞和良性痣、先天性痣、Sptiz痣、藍(lán)痣等多種痣組織都強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；其表達(dá)的降低被認(rèn)為與惡黑相關(guān)。Cyclin D1：有助于良性痣與痣樣惡黑或惡黑中的痣細(xì)胞成分鑒別，60%以上的惡黑全層表達(dá)，而痣完全沒有或只有淺表部位表達(dá)。 CD68：約80%以上的惡黑表達(dá)陽(yáng)性，有助于區(qū)別惡黑細(xì)胞和組織細(xì)胞。 其它：還有P53、CD40、CD44、角蛋白等

19、。b：瘤細(xì)胞HMB-45陽(yáng)性，痣細(xì)胞陰性。a：本例腫瘤源于原有的普通痣，瘤細(xì)胞呈嗜酸性、形態(tài)多樣，痣細(xì)胞呈嗜堿性、胞體較小。惡性黑素瘤：本例腫瘤（下方）起源于原有的先天性痣（上方）；a和b：惡性黑素瘤中Ki-67呈顯著陽(yáng)性表達(dá)，而痣組織中為陰性。無(wú)色素性惡性黑素瘤：a 瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，核分裂像明顯。b 可見彌漫的S-100蛋白陽(yáng)性表達(dá)，MART-1也為陽(yáng)性。注：在某些罕見的情況下，惡性黑素瘤不表達(dá)S-100，這時(shí)需要選用至少2種其它惡性黑素瘤標(biāo)記物進(jìn)行IHC染色。巨細(xì)胞性惡性黑素瘤：瘤細(xì)胞呈HMB-45陽(yáng)性。Ki-67A 痣樣惡性黑素瘤全層中表達(dá)活躍，可見大量陽(yáng)性著色的胞核；b 普通皮內(nèi)痣中只

20、有極少數(shù)散在的陽(yáng)性細(xì)胞；皮膚淋巴增生性疾病及相關(guān)腫瘤T細(xì)胞性淋巴瘤B細(xì)胞性淋巴瘤皮下脂膜炎樣T細(xì)胞淋巴瘤（SPTL）臨床表現(xiàn)：典型的為皮下脂肪出現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)肉色到紅色或紫色無(wú)癥狀結(jié)節(jié)、斑塊和腫塊。皮損可發(fā)生在許多部位，但常見于四肢和軀干。組織病理：典型浸潤(rùn)為細(xì)胞從真皮深部網(wǎng)狀層擴(kuò)展到皮下脂肪小葉或間隔，散在分布于真皮乳頭層。淋巴細(xì)胞往往圍繞脂肪細(xì)胞排列，形成花邊樣外觀。IHC特征：淋巴樣細(xì)胞通常CD45+、CD2+、CD3+、CD43+和CD45RO+.其中的組織細(xì)胞表達(dá)CD68。SPTL：皮下脂肪的致密浸潤(rùn)，產(chǎn)生特征性的花邊樣外觀。SPTL：該患者腿部出現(xiàn)多個(gè)潰瘍性結(jié)節(jié)。SPTL：組織細(xì)胞清

21、晰表達(dá)CD68。SPTL：淋巴細(xì)胞表達(dá)CD3。皮膚淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)癥臨床表現(xiàn)：皮損可單發(fā)，但多發(fā)皮疹更多見。病變最常位于面頸、背和上胸部，表現(xiàn)為盤狀、紅色或淡褐色丘疹或斑塊。中央常消退形成環(huán)狀。組織病理：真皮淺層和中層血管周圍有成熟的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。IHC特征：主要為T細(xì)胞，多為CD4+T淋巴細(xì)胞。細(xì)胞常表達(dá)Leu-8。中央消退形成環(huán)狀皮疹。面額可見多個(gè)紅色斑塊。左：真皮淺層和中層血管周圍有致密慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，形成袖口狀外觀。浸潤(rùn)的炎細(xì)胞幾乎全是小淋巴細(xì)胞。右：大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)CD4+彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤臨床表現(xiàn)：多見于老年患者的頭頸、軀干和四肢，藍(lán)紅色或紫紅結(jié)節(jié)。組織病理：腫瘤從真皮乳頭至網(wǎng)狀層呈彌

22、漫性浸潤(rùn)，皮下脂肪也常受累。常無(wú)向表皮現(xiàn)象，大多境界帶清晰。IHC特征：CD19+、CD20+、CD22+、CD79a+ 和單一形sIg/cIg。50%的表達(dá)bcl-2和bcl-6，通常CD5-和CD10-。Ki-67明顯表達(dá)（50%細(xì)胞）。CD20+腫瘤緊靠表皮，但無(wú)浸潤(rùn)。Bcl-6+Bcl-2+皮膚B細(xì)胞假性淋巴瘤臨床表現(xiàn)：與原發(fā)性皮膚B細(xì)胞淋巴瘤相似。組織病理：常為淺表性、結(jié)節(jié)性或局限性，但偶爾可彌漫并累及整個(gè)真皮層。IHC特征：B細(xì)胞和T細(xì)胞混合組成，有時(shí)后者占多數(shù)，生發(fā)中心在CD21染色下更明顯。輕鏈呈多克隆性。濾泡結(jié)構(gòu)外圍為濾泡樹突狀細(xì)胞群表達(dá)CD21。真皮內(nèi)致密的淋巴樣浸潤(rùn)伴明顯的生發(fā)中心。左圖：CD20示B細(xì)胞；右圖：T細(xì)胞層（CD3）包繞B細(xì)胞結(jié)節(jié)。乳房和乳房外Paget病組織病理：表皮表現(xiàn)均為角化過(guò)度或角化不全，常有棘層肥厚。浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)量不等，胞體較大，胞質(zhì)豐富，淡染或嗜酸性，胞核大呈空泡狀。細(xì)胞單個(gè)或成簇分布，偶見腺樣分化。IHC特征：c-erB-2、CK7、CAM5.2、EMA和G