1、第五章 生物反應器的檢測及控制第一節 生化過程主要檢測的參變量（1）溫度 ：整個發酵過程不同階段所維持的溫度。其高低與發酵中酶反應速率、氧溶解度和傳遞速率、菌體生長速率和產物合成速率等密切相關。（2）壓力:發酵過程中發酵罐維持壓力。供給細胞呼吸代謝所必需的氧，強化培養液的混合與傳質，可防止外界空氣中雜菌侵入,避免污染。一般維持在0.02-0.05MPa。（3）液面（或漿液量）：液面的高低決定反應器的裝料系數即影響生產效率。特別是通氣發酵過程，排氣會帶走一定水分，影響液面。（4） 泡沫高度：無論厭氣還是通氣發酵均有不同程度的泡沫產生。控制不好，影響裝料系數，降低生產率，同時可能造成染菌。（5）培

2、養基流加速度：實現優化連續發酵或流加操作，獲得最大發酵速率和生產效率的控制參數。（6）通氣量：每分鐘內每單位體積發酵液通入空氣的體積,也叫通風比,也是需氧發酵的控制參數。其大小與氧傳遞和其他控制參數有關,一般控制在0.5-1.0L/(L.min)。（7）黏度（或表觀黏度）：其大小可作細胞生長或細胞形態的一項標志,也能反映罐中菌絲分裂過程情況,通常用表觀黏度表示。其大小可改變氧傳遞阻力, 物質傳遞等。（8）攪拌轉速與攪拌功率：兩者與氧傳遞速率和發酵液混合狀態以及物質傳遞等有關。好氧性發酵不同階段控制不同轉數,以調節培養基中溶氧。（9）冷卻介質流量與溫度：不同發酵時期的發酵熱不同，要維持正常的發酵

3、溫度，需要的冷卻介質的流量和溫度也有所不同。需要通過測定和控制冷卻介質的進出口溫度和流量。（10）蒸氣壓強：無論是發酵培養基還是發酵罐體等都需要飽和蒸氣進行高溫高壓滅菌。（11）濕度：對于固體通風發酵，需要對通入發酵反應器的空氣溫度和濕度進行調控。另外，成品包裝車間的濕度也需要控制。（12）pH值 ：發酵過程中各種生化反應的綜合結果，是發酵工藝控制的重要參數之一。 pH值高低與菌體生長和產物合成重要相關。（13）溶氧濃度和氧化還原電位：需氧發酵中，不同發酵及發酵時期有不同溶氧水平，通過檢測溶氧濃度變化，了解發酵是否異常，進行發酵中間控制。對亞好氧發酵則通過氧化還原電位計來確定微小溶氧值。（14

4、）發酵液中CO2溶解濃度：通氣發酵中， CO2溶解濃度過高抑制細胞生長和產物形成；對光照自養的微藻培養，適當提高CO2溶解濃度有助于細胞生長。（15）培養基質濃度和產物濃度：發酵液中糖、氮、磷等對菌生長和產物合成有重要影響, 也是提高代謝產物產量的重要控制手段。產物濃度是發酵產物產量高低或合成代謝正常與否的重要參數 , 也是決定發酵周期長短的根據。（16）細胞濃度及酶活性：是控制發酵速率和效率的重要參數之一。生產上,常根據細胞濃度決定補料量和供氧量,以保證生產達預期水平。對酶的催化反應，酶活性也同等重要。第二節 生化過程常用檢測方法及儀器 要求：傳感器耐蒸氣加熱滅菌，較高精度和穩定性， 響應時

5、間短。一、檢測方式及儀器組成在線檢測：儀器的電極等可直接與反應器內的培養基接觸或可連續從反應器中取樣進行分析檢測。如溶氧、溫度、pH、壓力等。一般首選。檢測儀器的基本構成：被測樣品 傳感器 信號轉換器 輸出顯示器 信號放大器離線測量：從反應器中取樣出來后，用儀器或化學分析檢測。二、主要參數檢測原理及儀器在線無菌取樣系統：（非揮發性物質檢測取樣）揮發性物質檢測取樣1.溫度的測定溫度檢測儀包括：熱電阻檢測器、半導體熱敏電阻、熱電偶和玻璃溫度計。常用金屬熱電阻溫度計，以鉑電阻最常用，其次是銅電阻。鉑電阻耐熱、耐腐蝕、精度高、價高；銅電阻價低、易氧化、體積大。半導體熱敏電阻靈敏度高、響應時間短、體積小

6、、結構簡單、耐腐蝕、壽命長，但溫度與電阻值的關系非線性，使用不多。溫度測量與控制：小型發酵罐：半導體或水銀觸點溫度計大型發酵罐：鉑金電阻或半導體溫度計控溫方式：用簡單的On-Off或效果更佳的PID（畫面信息數字化）控制控溫介質：冷、熱水。2.壓強檢測最常用的是隔膜式壓力表。工業規模生產時，通常把壓力信號轉換成電信號，以便遠距離監控。3.液位和泡沫高度檢測液位檢測法主要有：壓差法、電容法和電導法，前兩種最常用。（1）電容式液面計（液位不同，兩根金屬電極間電位不同）（2）壓差法（反應器內上下兩點或三點間不同壓強計算出料液量和液面高度）泡沫高度測定：最常用電極探針測定，泡沫產生增多，其表面上升與電

7、極探針接觸而產生電信號。另用超聲波測定泡沫高度。泡沫控制：化學消泡和機械消泡4.培養基和液體流量測定最常用流量計，如液體質量流量計、電磁流量計、漩渦流量計和轉子流量計。5.氣體流量計實用類型分為：（1）體積流量型：根據流動氣體動能的轉換及流動類型改變而檢測流量。（小實驗室用轉子流量計）（2）質量流量型：利用流體的固有性質如質量、導電性、電磁感應及導熱等特性設計。最常用的是利用其導熱性。6.發酵液黏度檢測常用的黏度儀有：振動式黏度傳感儀、毛細管黏度計、回轉式黏度計以及渦輪旋轉黏度計等。（1）振動式黏度傳感儀：特制金屬棒插入反應器溶液，強制振動，其振動特性與液體黏度有關。（可保證無菌操作，但測定黏

8、度相對值，精確度較差。）（2）發酵液循環黏度測定： 在反應器中裝自動無菌取樣循環系統，發酵液通過取樣管路流過旋轉式黏度計或毛細管黏度計，實現連續在線檢測。（測定范圍：0.015-100Pa.s，響應時間10s，靈敏度為滿刻度的1）7.攪拌轉速和攪拌功率（1）攪拌轉速：罐容越小，轉速越高。檢測常用法磁感應式、光感應式：在攪拌或電極軸上裝設感應片切割磁場或光速而產生脈沖信號，脈沖頻率與轉速相同。測速發電機：在攪拌或電極軸上裝設一小型發電機，輸出電壓與轉速成線性關系。攪拌轉速調節：小罐采用直流電機、調速電機和變頻器等實行無級調速，大罐調速設備投入大，目前固定轉速。（2）攪拌功率生產規模的攪拌功率只測

9、定驅動電機電壓與電流，或直接測定電機攪拌功率，但此功率包含傳動減速機構的功率損失。實驗研究采用軸轉矩測定法。 P=2nM8.pH檢測最常用的是復合pH電極，結構緊湊，耐高熱。原理：玻璃電極和參比電極浸泡于某一溶液時，具有一定電位。注意：電極保護和標定。pH控制：加入酸堿試劑調節培養基中碳氮源的添加9.溶氧濃度檢測常用溶氧電極測定原理：氧分子在陰極上還原，有電流產生，產生的電流和被還原的氧量成正比。溶氧值采用飽和溶氧百分數和溶氧值表示，前者最常用。注意：測定時使電極周圍的液體適度流動，加強傳質，盡量減小與電極膜接觸的液膜滯流層厚度，減少氣泡和生物細胞在膜上積存，減少測定誤差。溶氧控制：根據發酵情

10、況流加碳源調節通風量和攪拌轉速10.溶解CO2濃度檢測原理：CO2分子能特殊選擇滲透通過特定的微孔膜，并使擴散通過的CO2進入飽和碳酸氫鈉緩沖溶液中，平衡后顯示的pH與溶解的CO2濃度成正比。注意：其工作原理同pH計類似。每次滅菌后均需校正后才能測定。11.氧化還原電位（ORP）ORP作為亞需氧生物反應中微量溶氧濃度的指示。檢測原理：基于溶液中的金屬電極上進行的電子交換達平衡時，具有相應的ORP，此值與溶液的pH和溫度以及溶氧有關。12.排氣氧分壓和CO2分壓的檢測（1）排氣氧分壓的檢測：主要有磁氧分析、極譜電位法和質譜法。氧是順磁性的，磁化率較大，在所有氣體中占重要地位。將被檢測樣品氣體導入

11、磁場，非均勻磁場范圍內作用在氣體分子上的力導致壓強變化，即在均勻磁場和無磁場的空間存在壓強差：p M Co2（2）排氣中CO2分壓檢測常用紅外線二氧化碳測定儀和二氧化碳電極。紅外線二氧化碳測定儀原理：CO2在近紅外波段有吸收譜，吸收峰在2.6-2.9103和4.1-4.5103nm間。吸收峰波段內，通過含有CO2的氣體時，光強度衰減。I 。、 I入射光和衰減后光強度；光吸收系數；L光透過氣體的距離，m；Co2 CO2氣體濃度，13.細胞濃度測定（1）全細胞濃度測定：分濕重法、干重法、濁度法、濕細胞體積等。其中干重法最準確，其余三種簡便。在線檢測全細胞濃度必需滿足：響應連續、迅速；靈敏度在0.0

12、2g/L以上；電極本身對細胞無影響；檢測過程對細胞無損傷，不必加藥物；可檢測含固體微粒的發酵液；易于清洗、滅菌。流通式濁度計滿足上述要求。不同細胞采用不同光，如可見單色光、激光或紫外光作為光源照射細胞。全細胞濃度與光密度值呈線性關系。注意： 適于游離細胞；氣泡會干擾讀數；適當提高發酵液流過光電比色皿速度，以免細胞附壁增大測定誤差。（2）活細胞濃度測定原理：利用活細胞催化反應或活細胞本身特有物質而使用生物發光或化學發光法進行測定。例如：通過檢測發酵液的ATP來測定活細胞濃度。 ATP熒光素O2氧化熒光素PP1CO2熒光 熒光強度與ATP濃度成正比。三、生物發酵液中營養成分與產物分析大多數成分是通

13、過微孔陶瓷取樣器或滲透膜取樣器取樣后，使用HPLC或GC等儀器或化學方法檢測。第三節 生物傳感器的研究開發與應用生物傳感器：由固定化的生物材料和適當的換能器件相結合而構成，換能器把生化反應信號轉換成可定量的檢測信號的檢測器件。原理：利用生物細胞自身或其中所含的酶等有生物功能的物質制成。生物材料包括：固定化酶、微生物、抗原抗體、生物體組織或器官等換能器：電化學電極、熱敏電阻、離子敏感場效應管、光纖和壓電晶體等。一、生物傳感器在微生物發酵過程檢測上的應用（1）流式細胞儀（Cell Sorter）：被檢測的含細胞試樣流過檢測器，細胞逐個滴下，由激光檢出。根據預先設定的各種細胞的電特性進行識別，可統計

14、出細胞的尺寸分布及細胞齡等特性。（2）各種酶電極：用于培養基營養成分如糖類、營養鹽以及產物等的分析檢測。具體檢測的酶反應原理，以及一些生產發酵中已研制開發的生物傳感器，見材料p83-84表1-5-3和1-5-4。二、生物傳感器的類型及結構原理生物傳感器膜（固定化酶、微生物等）與其他有機或無機敏感膜的區別：不產生界面電勢僅與待測物質發生生物催化反應，生成能使生物膜層下面的敏感層產生響應的物質，屬二次響應。生物傳感器特點（理論）：具有特異性和多樣性不需添加化學反應試劑，檢測方便、快速可自動和在線檢測注意：事實不耐高溫，穩定性不好，壽命短（急需解決）用于在線檢測存在問題。1.酶電極（1）酶電極的響應

15、時間和響應信號輸出穩態響應：酶電極置于待檢測溶液時，電極信號隨時間逐漸增加，最后趨于穩定。目的物質濃度測定步驟：以時間和響應信號為坐標，作出不同濃度標準物質響應曲線。再以標準物質的濃度和最初響應速率（由求得）為坐標，作出響應標準曲線。測定樣品液的時間和響應信號的響應曲線，對照標準曲線，查出樣品液中物質濃度。響應時間：當電極參加某一樣品溶液或樣液中待測物質濃度改變后，電極信號輸出達到穩態值所需的時間。通常，輸出信號達穩態值的95所需時間稱為95響應時間或簡稱響應時間。響應時間的影響因素：酶膜的厚度和擴散速率以及被測系統的基質濃度（2）酶電極的專一性和抗離子干擾實際檢測時，離子干擾和目的檢測物質結

16、構類似物等均會導致酶電極的專一性，降低其測量的準確性和精度。（3）酶電極的穩定性和使用壽命 穩定性受酶失活和固定化酶滲漏影響。主要受被測溶液特性如是否存在使酶失活或分解的蛋白酶等，或過高或過低的pH等。提高穩定性和使用壽命的方法：酶固定化時，酶層上用半透膜保護或使用輔酶等方法；注意正確的電極保存和使用方法。（4）某些酶電極的原理說明（見材料p87）2.微生物電極可利用其中某種酶的催化作用，也可利用其中多種酶進行催化。較酶電極使用壽命長。分微生物呼吸性測定型和代謝產物電極活性物質測定型。（1）呼吸性測定型原理：微生物呼吸作用消耗氧或產生CO2，用氧電極或CO2電極進行檢測。其濃度變化與待測物質濃度有相應關系。（2）代謝產物測定型原理：微生物活細胞使有機物代謝生成相應代謝產物，代謝產物使電極產生響應。3.免疫電極優點：重現性強、靈敏度、專一性高和檢測速度快。（1）標記免疫電極原理：用酶、紅血球或核糖體等作為標記物，在免疫反