1、RapidPurificationofHigh-activityTaqDNAPolymerase本次試驗歷時六天，分為準備工作（兩天），酶的誘導表達（一天），酶的提取（一天），酶的透析以及酶的保存（兩天）。下面按時間順序敘述。第一天準備工作（1）清洗器皿。100ml量筒：34個1000ml量筒：12個500ml量筒：23個250ml量筒：1個（沒有亦可）1000ml燒杯：2個小燒杯：2個500ml三角瓶：1個150ml三角瓶：23個500ml離心管：4個250ml離心管：2or4個50ml離心管：12or6個10ml移液管：56個藥勺：34個透析袋+超純水（滅菌）透析夾+超純水（滅菌）細菌濾+

2、濾膜（滅菌，切勿烤干！）槍頭（1ml12盒，0.2ml2盒）小管（1.5ml1瓶，滅菌）定性濾紙：兩包新的10ml離心管：滅菌，保存酶用。磁轉子：蒸餾水洗，不必滅菌。同時準備一大瓶超純水備用。Note：（一）整個清洗過程都要戴手套（干燥后操作要戴PE手套）。（二）器皿最后都要用超純水潤洗，倒放在濾紙上干燥。包上牛皮紙滅菌。（三）離心管干燥后封口滅菌。（四）藥勺用鹽酸處理除去污漬銹斑，滅菌。（2）配LB培養基。（按照分子克隆實驗指南配方）2L滅菌。預備明晚搖菌。（3）菌種活化，劃單斑。取98.11的DJP菌種劃單斑，37C培養，預備明晚搖菌。Note：提取Taq酶每次只用上次保存的菌種，每次搖菌

3、后都要保存菌種！PROCEDURALEXPLANATION：作蛋白表達的細菌和感受態細菌都要經過轉瓶活化過程。第二天準備工作（1）將昨晚劃的平板放在4C預備晚上搖菌。（2）配溶液BufferA，LysisBuffer，StorageBuffer并滅菌。BufferA：50mMTrisHClpH7.950mMDextrose1mMEDTAK+配法1M0.5MFOR400mlinducePreLysisBuffer)TrisHCl(pH7.9)20mlEDTAK+(pH7.9)0.8mlDextrose3.6g加超純水至390ml，pH計調至7.9，定容至400ml。Note：（一）pH值要在7.

4、9以上，7.910以下。（用KOH和HC1調）水。（二）最后酶要懸浮在BufferA中，因此要用超純水。其他緩沖液用蒸餾水即可，也可用超純LysisBuffer：10mMTrisHCl(pH7.9)50mMKCl1mMEDTAK+(pH7.9)0.5%(v/v)Tween-200.5%(v/v)NP401mMPMSF(用前再加)配法：(FOR200ml)1MTrisHCl(pH7.9)2mlTOC o 1-5 h z0.5MEDTAK+(pH7.9)0.4ml1MKCl10ml10%Tween2010ml10%NP4010ml滅菌后加入PMSF0.03484g。(以約300500卩1異丙醇溶解

5、，緩慢加入)Note：PMSF可用異丙醇溶解后緩慢加入，也可直接將粉末倒進去劇烈振蕩。(PMSF劇毒,注意防護）PreLysisBuffer：即BufferA中加Lysozyme至4mg/ml。（現配現用）lxStorageBuffer：（200ml，溶解酶用，-20C保存）50mMTrisHCl（pH7.9）0.1mMEDTAK+50mMKCl0.5mMPMSF1mMDTT配法：1MTrisHCl（pH7.9）10ml0.5MEDTAK+（pH7.9）0.04ml1MKCl10mlPMSF0.01743g定容至100ml，再加甘油100ml。滅菌后加入過濾除菌的DTT。1MDTT過濾除菌后加

6、入0.2ml,即終濃度為1mM（配法：1.543g10m1超純水或0.7715g5m1超純水，過濾除菌后小管分裝。-20C保存）Note：（一）PMSF可用異丙醇溶解后緩慢加入，否則易析出。（二）DTT易降解，因此要在Buffer滅菌后加入，并且在低溫保存。1xStorageBuffer：（2L透析用）50mMTrisHCl(pH7.9)0.1mMEDTAK+50mMKCl0.5mMPMSF1mMDTT配法：1MTrisHCl(pH7.9)100ml0.5MEDTAK+(pH7.9)0.4ml1MKCl100mlPMSF0.1743g定容至1000ml，再加甘油1000ml。滅菌后加入過濾除菌

7、的DTT。1MDTT過濾除菌后加入2ml。挑斑搖菌5mlLB加Amp至80yg/ml。2管(用同一個斑，并標記該斑)，37C過夜。(本次試驗中由20：309：30)第三天酶的誘導表達轉瓶：LB加Amp至80yg/ml(即濃度為100mg/ml的Amp在1L的培養基中加800卩1),加菌液500pl/L,37C搖菌。預計21：00可加IPTG誘導。Note：本次試驗中由10：3020：00,OD550值達到1.663,應在0.8左右最好。達到1.8亦可。保存菌種：400卩1菌液加400pl菌種保存液，-70C保存。清理器皿：檢查是否有未滅菌的器皿,將用過的器皿清洗滅菌。測OD值，力口IPTG(2

8、50mg/ml)至125mg/L(=0.5mM。500pllL)37C搖菌，12hr。Note:誘導IPTG一般加到1mM,誘導時間相對較短，2mM為飽和值。本次試驗將濃度降低,時間相應延長，以便過夜搖菌。加IPTG前取樣(500卩42)以備做蛋白膠對照。明早離心前再取樣預備跑蛋白膠。菌液離心后收集菌體4C保存。IPTG誘導12hr,明早8:00前要調水浴鍋至75C(精確！)同時離心轉子預冷至4C。第四天提Taq酶為避免污染，所有操作都要戴手套，常換手套和槍頭。收集菌體：8:30離心，5000rpm,4C,15min,500ml離心管x2,收集兩次，共2L。Note：以下操作在冰上進行，與制感

9、受態類似。洗滌：Add100mlBufferAperliteroriginculturevolume,轉至250ml離心瓶x2；6000rpm,4C，12min，冰上。(3)PreLysis：Add50mlPreLysisBufferperliteroriginculturevolume(先加50mlBufferAperliter,充分懸浮，再加Lysozyme至4mg/ml,搖勻)，室溫放置15min,合并至一個250ml離心瓶中。熱變性沉淀雜蛋白：在LysisBuffer中加入PMSF,待用。加入等體積的LysisBuffer,轉入250ml三角瓶中，75C,1hr。除去沉淀：15000r

10、pm或17000rpm(Beckman)4C,15-20min。取上清，轉入干凈的三角瓶中，用滅菌的100ml量筒量取體積。(NH4)2SO4沉淀Taq酶：用小燒杯稱取硫酸銨(按30g/100ml上清)在室溫慢加慢搖。邊加邊搖。本次試驗搖了兩個小時。Note：（一）避免局部鹽濃度過高導致Taq酶析出，要加一點搖一會。（二）搖燒杯時要注意不要產生泡沫，泡沫會使酶活性降低。（三）大約加入一半硫酸銨時溶液會渾濁，若沉淀出現太早表明雜蛋白未除盡，可在透析之后離心除去。（7）離心沉淀Taq酶：轉入50ml離心管，15000rpm或18500rpm（Beckman）室溫，25min。棄上清，沉淀重懸在5mlBufferAper100ml上清。Note：（一）若在4C離心則沉淀很少。（二）上清可倒在三角瓶中多離心幾次便可以將沉淀完全離心下來。（8）透析：將透析袋用透析夾夾緊，透析袋中避免有氣泡，可用手將氣泡擠出（戴手套！）每個透析袋約10ml在StorageBuffer中加入DTT（切記！）在1000ml燒杯中倒入約400500ml,放入磁轉子，4C緩慢攪拌，每隔12hr換一次透析液。Note：（一）透析袋可多折幾次以免夾得不緊。（二）透析時燒杯要封口（可用PE手套）第五天透析早晚各換一次透析液，原透析液倒掉，切勿造成酶的污染！Note：StorageBuffer平時放在4C可防