1、蛋清中提取溶菌酶實驗二 柱層析法提取溶菌酶實驗?zāi)康恼莆侦o態(tài)和動態(tài)離子交換的方法；掌握從生物材料中提取活性蛋白質(zhì)方法。實驗材料起始緩沖液： 0.1M 磷酸鈉緩沖液（pH7.0）洗脫液： 50mM NaCl溶液200mL（溶劑：起始緩沖液） 500mM NaCl溶液150mL（溶劑：起始緩沖液）再生溶液：0.5M NaOH溶液儀器：磁力攪拌器等其他材料：新鮮雞蛋實驗流程樣品的預(yù)處理靜態(tài)吸附和洗滌動態(tài)洗脫雜質(zhì)和溶菌酶再生樹脂洗滌管道背景知識蛋清中的溶菌酶 一種堿性球蛋白，Mw14700Da， pI10.511.0，在酸性條件下（pH47）較耐熱，而在中、堿性條件下熱穩(wěn)定性較差。 蛋清中主要的蛋白質(zhì)

2、卵白蛋白，占54，pI4.54.8，分子量約為 45000Da； 卵伴白蛋白，pI6.056.6，分子量約為 7000078000Da； 卵球蛋白，pI5.55.8，分子量約為3600045000Da； 卵類粘蛋白，pI3.94.3，分子量約為28000Da； 卵粘蛋白粘度較大且不溶于水。實驗原理蛋清中的蛋白質(zhì)大多數(shù)呈酸性或者弱酸性，在pH7.0的條件下，這些蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷或者少量的正電荷；而等電點約為11.0的溶菌酶帶正電荷，牢固地吸附在陽離子交換樹脂上，再通過不同離子強(qiáng)度的 NaCl溶液將弱酸性蛋白質(zhì)和溶菌酶分級洗脫下來。離子交換層析分離溶菌酶Na+ 陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂陽離子交換

3、樹脂+-靜態(tài)和動態(tài)離子交換法 靜態(tài)離子交換法優(yōu)點：操作簡單；設(shè)備要求低；適合于粘度較高的樣品。 缺點： 交換不完全；不適宜用作多種成分的分離； 而且樹脂有一定的損耗。動態(tài)離子交換法優(yōu)點：分辨率高，適合多組分樣品的分離；交換完全；洗脫液中溶質(zhì)濃度高；缺點：設(shè)備要求高；操作參數(shù)多。洗脫定義：離子交換（即吸附）完成后，將樹脂上吸附的物質(zhì)重新轉(zhuǎn)入（即解吸附）溶液的方法。洗脫方法：改變離子強(qiáng)度，在緩沖液中加入適當(dāng)?shù)腒Cl、NaCl等非緩沖鹽類。改變pH值，用緩和的酸或者堿洗脫。洗脫方式分階段梯度洗脫：先采用洗脫能力弱的溶液，使易解吸附的組分流出，然后依次使用洗脫能力強(qiáng)的溶液，解吸附較難洗脫的組分。連續(xù)梯

4、度洗脫：其洗脫效果優(yōu)于分階段梯度洗脫，適合于高分辨率的分離目的，或者摸索分階段梯度洗脫的條件。離子強(qiáng)度分階段洗脫連續(xù)洗脫離子強(qiáng)度洗脫峰洗脫峰連續(xù)梯度洗脫的裝置 C = CB -（CB - CA）（1 - V2/V1）B1/A1 CA 、CB 梯度混合器A瓶、 B瓶的濃度； A1 、B1 A瓶、B瓶的橫切面積； V2流經(jīng)層析柱的體積，V1梯度洗脫液的總體積。總結(jié)離子交換的操作流程樹脂的選擇（陽離子交換樹脂還是陰離子交換樹脂）樹脂的預(yù)處理（鹽型還是氫型、羥型）緩沖液的種類、pH值和離子強(qiáng)度洗脫樹脂的再生離子交換的操作參數(shù)流速（吸附的速度和洗脫速度）樣品的體積和濃度實驗步驟樣品的預(yù)處理 取2個新鮮雞

5、蛋，在其一端敲一個小洞，收集蛋清，加入約其體積1.5倍的起始緩沖液，攪拌均勻，用4層紗布過濾除去不溶性物質(zhì)，檢查其pH值是否為7.0，否則用0.5M酸、堿調(diào)節(jié)。靜態(tài)吸附和洗滌靜態(tài)吸附溶菌酶：傾出層析柱中平衡好的樹脂，傾去多余平衡緩沖液，將蛋清溶液倒入樹脂中，在磁力攪拌器上輕輕攪拌，室溫下攪拌吸附約45min，注意攪拌速度（勿起大量泡沫、勿打破樹脂）。吸附結(jié)束，吸取 200L 上清于 dorf管中、4度保存?zhèn)溆茫?biāo)記“1”），傾倒上清。洗滌雜質(zhì)：取與樹脂體積相當(dāng)?shù)钠鹗季彌_液攪拌洗滌樹脂約5min，重復(fù)2次，每次洗滌后，吸取 200L 洗滌液于 dorf管中、4度保存?zhèn)溆茫?biāo)記“2”“3”），傾去

6、洗滌液。 動態(tài)洗脫用少量起始緩沖液將樹脂調(diào)勻，重新裝填層析柱，裝填結(jié)束后，用起始緩沖液（用滴管沿層析柱內(nèi)壁緩緩加入，勿沖擊樹脂面，高度約2cm即可）封閉樹脂面，將層析系統(tǒng)組裝好，核酸蛋白檢測儀調(diào)基線（T檔調(diào)“100”，A檔調(diào)“0”），開始用 50mM NaCl洗脫液恒速洗脫雜質(zhì)。（流速約23mL/min)2. 洗脫雜蛋白：洗脫開始，即計時，然后每隔2min，記錄下吸光值和電導(dǎo)率值（使用LP層析系統(tǒng)的同學(xué)記錄電導(dǎo)率值），當(dāng)洗脫峰結(jié)束（流出液的吸光值從開始上升到下降，直至平穩(wěn)），洗脫完成。在洗脫峰吸光值最大處收集少量洗脫液于 dorf管中，標(biāo)記“4”）3. 收集溶菌酶：更換 500mM NaCl洗脫液，同樣記錄，同樣在吸光值最大處收集少量洗脫液于dorf管中，標(biāo)記“5”），不同的是，此時是溶菌酶的洗脫峰，所以整個洗脫峰要收集于燒杯中，4度保存。再生樹脂 用0.5M NaOH溶液（約1倍柱床體積）洗滌樹脂，然后用蒸餾水將堿液沖洗干凈，樹脂回收于燒杯中，浸泡于蒸餾水中，保鮮膜蒙好，室溫放置。洗滌管道 將管道系統(tǒng)連接好，