1、水稻轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)操作一、 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)（以水稻成熟胚為試材誘導(dǎo)愈傷組織）1 消毒：取水稻成熟種子，人工或者機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無(wú)菌斑的種子，按以下步驟消毒：1） 將種子放入100ml無(wú)菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分鐘；2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸鈉（NaClO）溶液（次氯酸鈉：水（V/V）=9:21），放入搖床振蕩60分鐘；3) 倒去次氯酸鈉溶液，用無(wú)菌蒸餾水清洗種子4-5遍，最后一遍浸泡30分鐘。 2誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)：（以下步驟需無(wú)菌操作）1）種子放在無(wú)菌濾紙上吸干，置成熟胚于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿10顆；2） 操作完畢用封口膜封好培養(yǎng)皿，在26培養(yǎng)箱，（光）暗培養(yǎng)10-1

2、5天；3） 在超凈工作臺(tái)上打開培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然散落的胚性愈傷組織（淡黃色，致密呈球狀），在26 光（暗）培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)2周（繼代兩次）。(沒(méi)有脫落的可在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)7天，次數(shù)多了效果會(huì)減弱)二、預(yù)培養(yǎng) 將繼代兩次的狀態(tài)較好的愈傷顆粒，接種到預(yù)培養(yǎng)基26 暗培養(yǎng)4天。預(yù)培養(yǎng)基碳源為20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度滅菌30min）。乙酰丁香酮（AS）濃度為100 M (每毫升培養(yǎng)液中加入100 mM的AS 1微升)三、 農(nóng)桿菌（工程菌）培養(yǎng)把-70保存的菌種首先用含125 mg/L壯觀霉素、50 mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基，在26-28，150 r/min振蕩培養(yǎng)

3、16-18 h，活化轉(zhuǎn)入打靶載體的農(nóng)桿菌。在預(yù)培養(yǎng)的第2天，用含125 mg/L壯觀霉素、50 mg/L利福平的YEB固體培養(yǎng)基劃線接種農(nóng)桿菌菌株，28 靜止培養(yǎng)2-3 d。3 d后將單菌落農(nóng)桿菌刮入農(nóng)桿菌懸浮液體培養(yǎng)基或者AAM培養(yǎng)基，28 振蕩培養(yǎng)34 h。分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度，并將其濃度調(diào)至0.5-1.0 OD600四、 感菌與共培養(yǎng)1）將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織接入100 mL三角瓶,中，加入調(diào)制好的農(nóng)桿菌懸浮液侵染30分鐘，期間搖動(dòng)數(shù)次；2）倒去菌液，將愈傷組織取出，置于無(wú)菌的濾紙上吸干表面菌液（30-40分鐘）；3）將愈傷組織置于共培養(yǎng)基上(共培養(yǎng)基上面墊上一層9cm無(wú)菌濾紙)。19-

4、20（組培室）暗培養(yǎng)3天。五、愈傷組織的抗生素篩選將共培養(yǎng)后的愈傷組織取出，用無(wú)菌水快速搖動(dòng)清洗4次，然后加入無(wú)菌水浸泡10min,使愈傷內(nèi)部的菌體游離出來(lái)；倒去洗液，再用含400mg/L頭孢的無(wú)菌水浸泡20min。再用含400mg/L頭孢的無(wú)菌水沖洗一次，最后置于無(wú)菌濾紙上瀝干3h。第一輪篩選：將瀝干的愈傷轉(zhuǎn)入含400 mg/L羧芐青霉素（Car）和400 mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基（沒(méi)有選擇壓力）上，26暗培養(yǎng)5-7天； 然后將愈傷轉(zhuǎn)到含400mg/L羧芐青霉素（Car）、400 mg/L頭孢霉素和50mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇，26，暗培養(yǎng)，兩周一次，培養(yǎng)兩次。六、抗性愈傷組織的

5、誘導(dǎo)分化和生根1）將篩選獲得的抗性愈傷組織接入預(yù)分化培養(yǎng)基中，26，暗培養(yǎng)5-7天。2）預(yù)分化培養(yǎng)的抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（改用三角瓶或者平底試管）26，2000Lx光照培養(yǎng)，再生轉(zhuǎn)基因植株。3）待小苗長(zhǎng)到3-5cm;轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上發(fā)根。4）將根系健壯的植株移入盆砵，涼棚過(guò)渡3-5天；然后移到自然條件下生長(zhǎng)，直至成熟。注：分化過(guò)程中不可將愈傷繼代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因苗從分化到移栽時(shí)間大約為三個(gè)月左右。將根部和莖葉分化得較完好的苗從試管挑出（苗長(zhǎng)至試管頂部，就要及時(shí)開蓋），打開封口膜，加入適量無(wú)菌水（防止培養(yǎng)基長(zhǎng)菌），煉苗3天至一周左右，然后洗去瓊脂，移栽到溫室的土缽中生長(zhǎng)，檢測(cè)。以上操作步驟皆在無(wú)菌

6、條件下進(jìn)行。七、轉(zhuǎn)化苗的檢測(cè)驗(yàn)證1）GUS檢測(cè)：將準(zhǔn)備好的材料浸泡在染液里，37保溫過(guò)夜。GUS染液成分見附錄。2）GFP檢測(cè)：將材料放在共聚焦顯微鏡下觀察成像。3）PCR檢測(cè)：設(shè)計(jì)潮霉素抗性基因引物HYG-F 5 CTTCTGCGGGCGATTTGT 3 HYG-R 5 CAGCGTCTCCGACCTGAT 3 PCR 反應(yīng)條件為：95變性5min，55退火2min，72延伸2min， 72保溫10min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。4）潮霉素快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因幼苗的方法（具體見附錄）。附錄：各種母液及培養(yǎng)基的配制方法一、激素的配制激素溶解方法母液濃度6-BA; KT10

7、0mg樣品加稀堿1ml振蕩溶解（1M KOH），再用蒸餾水定容100mL；4保存1 mg/mlNAA; IAA100mg樣品加稀堿1ml振蕩溶解（1M KOH），再用蒸餾水定容100mL；4保存1 mg/ml2，4-D2,4-D 100 mg加少量酒精溶解，再用蒸餾水定容100mL; 4保存1mg/mlAS0.196g AS加10mL二甲基亞砜（DMSO）溶解，用1.5mleppendorf管分裝成小份-20貯存。配制時(shí)注意帶乳膠手套操作。 100mM1） 抗生素鏈霉素（Str）50mg/ml：溶解0.5g鏈霉素硫酸鹽于滅菌去離子水中，最后定容至10ml, 過(guò)濾滅菌分裝成小份-20貯存。利福平

8、50mg/ml：溶解0.5g利福平于滅菌去離子水中，最后定容至10ml, 過(guò)濾滅菌分裝成小份-20貯存壯觀霉素（Spec）125mg/ml：溶解1.25g壯觀霉素于滅菌去離子水中，最后定容至10ml, 過(guò)濾滅菌分裝成小份-20貯存。羧芐青霉素（Car）400mg/ml：溶解4g羧芐青霉素二鈉鹽于滅菌去離子水中，最后定容至10ml, 過(guò)濾滅菌分裝成小份-20貯存。頭孢霉素400mg/ml：溶解4g頭孢霉素于滅菌去離子水中，最后定容至10ml, 過(guò)濾滅菌分裝成小份-20貯存卡那霉素（Kan）50mg/ml：溶解0.5g卡那霉素于滅菌去離子水中，最后定容至10ml, 過(guò)濾滅菌分裝成小份-20貯存。二

9、、各類基本培養(yǎng)基成分表：各類基本培養(yǎng)基MSN6CCB5大量元素(g/L)(g/L)(g/L)(g/L)NH4NO31.65/0.64/KNO31.92.831.2122.5KH2PO40.170.40.1360.15MgSO47H2O0.370.1850.2470.25CaCl22H2O/CaCl20.44/0.3320.166/0.1250.588/0.440.15(NH4)2SO4/0.463/0.134微量元素(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)KI0.0830.080.0090.075H3BO30.620.160.310.3MnSO44H2O2.23

10、0.441.1651ZnSO47H2O0.860.150.5750.2Na2MoO42H2O0.0250.240.025CuSO45H2O0.00250.0250.0025CoCl26H2O0.00250.0280.0025Fe2+-EDTA(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)FeSO47H2O2.782.782.782.78Na2-EDTA2H2O3.733.733.733.73有機(jī)成分(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)Nicotinic acid0.050.051.20.1Pyridoxine-HCl(VB6)0.0

11、50.050.20.1Thiamine-HCl(VB1)0.040.11.71Glycine0.20.20.4/Inositol10101810麥芽糖20g甘露醇25gagar 8gvc60mg1）有機(jī)母液儲(chǔ)存液（4度保存）：1煙酸（Nicotinic acid）1mg/ml2鹽酸吡哆醇(VB6)1mg/ml3鹽酸硫胺素(VB1)10 mg/ml4肌醇(myo-Inositol)10 mg/ml5Glycine2 mg/ml B5 有機(jī)工作液為從序號(hào)為1、2、3 各取1mL； 序號(hào)4取10 mL Ms 有機(jī)工作液從序號(hào)為1、2各取0.5mL, 3取40l；4取10ml;5取1ml N6 有機(jī)工

12、作液從序號(hào)為1、2各取0.5 ml ,3取100l；4取10ml;5取1ml2）鐵鹽配制（4度保存）：注：配制順序如下1. 稱取2.78g FeSO47H2O溶解于200ml去離子水中（A）。2. 稱取3.73g Na2-EDTA2H2O溶解于200 ml去離子水中（B）。3. 將B置于70水浴鍋中直至溶質(zhì)完全溶解（C）。4. 將A倒入C中混合，置于70水浴鍋中保溫2h。5. 定容至1L。三、農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的YEP液體培養(yǎng)基配方（每升含量）：酵母提取物1g蛋白胨10g蔗糖5gMgSO47H2O1.027pH滅菌結(jié)束后加抗生素至終濃度為： 利福平 50mg/L 壯觀霉素（Spec）125mg/L四

13、AA培養(yǎng)基儲(chǔ)存液 (室溫儲(chǔ)存)大量元素g/L（10倍）KCl29.5NaH2PO41.5MgSO47H2O2.5CaCl22H2O1.5微量元素g/L（100倍）MnSO44H2O1.0ZnSO47H2O0.2H3BO30.3KI0.075CuSO45H2O0.0025Na2MoO42H2O0.025CoCl26H2O0.0025微量元素配制中Na2MoO42H2O 單獨(dú)溶解后與其他物質(zhì)混合后定容到1L,室溫保存。3）水稻苗期水培營(yíng)養(yǎng)液配方：Macro-nutrient solution (mM)元素終濃度使用鹽類分子量(g/mol)母液(103)用量(g/L)N2.5(1.25 mM)NH4

14、NO380.04100P0.3KH2PO4136.0940.83K1(0.35mM)K2SO417460.9Ca1CaCl22H2O147147Mg1MgSO47H2O246.5246.5SiO20.5Na2SiO39H2O284.2142.1Micro-nutrient solution (M) Mn9MnCl24H2O197.921.781Mo0.39Na2MoO42H2O241.950.0944B20H3BO361.831.2366Zn0.77ZnSO47H2O287.560.2214Cu0.32CuSO45H2O249.680.0799Fe20FeSO47H2O+Na2_EDTA278

15、.025.57注: 1 制備大量元素營(yíng)養(yǎng)液母液時(shí)，各種鹽類分別溶解，分別儲(chǔ)存，使用時(shí)每升營(yíng)養(yǎng)液加1mL母液。2 制備微量元素營(yíng)養(yǎng)液（除Fe外）時(shí)，先放500mL去離子水，稱取各種鹽類逐一溶解后，入容量瓶加蒸餾水稀釋至1L，制成母液，使用時(shí)每升營(yíng)養(yǎng)液加1mL母液。3 Fe的制備：溶解5.57g FeSO47H2O于200 mL蒸餾水，再另溶解7.45g Na2-EDTA 200mL蒸餾水中，加熱Na2-EDTA（大約70度），加入FeSO47H2O，不斷攪拌，然后于70度恒溫箱中螯合2h，冷卻定容至1L，儲(chǔ)于棕色瓶中，使用時(shí)每升營(yíng)養(yǎng)液加1mL母液。4 調(diào)節(jié)pH為5.5。5 銨營(yíng)養(yǎng)時(shí)，加入硝化抑制

16、劑（雙氰胺），每升營(yíng)養(yǎng)液加2mg雙氰胺（終濃度）。各人配制時(shí)，應(yīng)注意所用的鹽類和分子量，檢查鹽用量準(zhǔn)確無(wú)誤。五、GUS染色液配方(1) 制備方法：A液：稱取NaH2PO42H2O3.12g溶于蒸餾水，定容至100ml。B液：稱取Na2HPO412H2O7.17g溶于蒸餾水，定容至100ml。(2) 取100ml B液與40ml A液混合（混合后pH值約7.03），用NaH2PO42H2O調(diào)至pH7.0。(3) 染色液：試劑終濃度母液濃度配20ml所需母液量（ml）磷酸鈉緩沖液（pH7.0）100mmol/L200mmol/L10Na2EDTA10mmol/L50mmol/L4K3Fe(CN)6

17、1mmol/L40mmol/L0.5 K4Fe(CN)61mmol/L40mmol/L0.5TritonX-1000.5%(v/v)0.1甲醇20%(v/v)4ddH2O5.9（補(bǔ)水至20ml）X-Gluc0.5mg/ml10mg說(shuō)明：1.除了TritonX-100, 甲醇, X-Gluc不用滅菌外其他的母液都要滅菌.其中K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6要用過(guò)濾滅菌的方法2.GUS活性的精確定位需要有亞鐵離子。GUS酶水解其底物X-Gluc產(chǎn)生可溶性無(wú)色的吲哚基衍生物，它可擴(kuò)散到其他部位，必須經(jīng)氧化縮合成二聚體，才能形成不溶性的藍(lán)色沉淀，二聚體化由氧化催化劑(如亞鐵氰化鉀、過(guò)氧化物酶或過(guò)氧化氫酶等)催化，若不加Fe2-，則僅形成可溶性中間產(chǎn)物而擴(kuò)散，加亞鐵氰化鉀后因吲哚基二聚體化而不擴(kuò)散，不溶性藍(lán)色沉淀形成越快，GUS酶的定位越精確。材料準(zhǔn)備：(1) 瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)取浸染后的愈傷，穩(wěn)定表達(dá)取分化前的愈傷。(2) 葉片、幼根等制成徒手切片（或剪成小