1、藥物毒理學實驗藥物毒理學實驗指導老師：指導老師： 劉劉 娟娟 羅藝晨羅藝晨 毒性試驗 給實驗動物進行不同途徑、不同期限的染毒、檢測各種毒性終點的實驗。其目的是確定無害作用水平、毒性類型、靶器官、劑量-反應關系，為安全性評價或危險性評價提供重要的資料。 評價一個藥物的毒性試驗方法：急性毒性試驗、亞慢性毒性試驗、慢性毒性試驗、特殊毒性試驗（遺傳、生殖、致突變等）、其它毒性試驗（刺激性、過敏性、溶血性等）等。 評價一個藥物的毒性指標：安全劑量（safety dose）、最小中毒劑量（minimal toxic dose）、最大耐受劑量（MTD）、半數致死量（LD50）、治療指數（TI=LD50/ED

2、50）、安全范圍（MS=LD1/ED99或LD5/ED95） 急性毒性試驗急性毒性試驗 是指一次或24小時內多次染毒的試驗，是毒性研究的第一步。要求采用嚙齒類或非嚙齒類兩種動物。通常為小鼠或大鼠采用經口、吸入或經皮染毒途徑。急性毒性試驗主要測定半數致死量（濃度），觀察急性中毒表現， 亞慢性毒性亞慢性毒性 是指實驗動物連續多日接觸較大劑量的外來化合物所出現的中毒效應。所謂較大劑量，是指小于急性LD50的劑量。“多日”的確切天數，至今尚無完全統一的認識。一般認為在環境毒理學與食品毒理學中所要求的連續接觸為36個月，而在工業毒理學中認為13月即可。 慢性毒性試驗慢性毒性試驗 是確定外來化合物的毒性下

3、限，即長期接觸該化合物可以引起機體危害的閾劑量和無作用劑量。一般認為環境毒理學與食品毒理學則要求實驗動物染毒1年以上或2年，而工業毒理學慢性試驗動物染毒6個月或更長時間。 特殊毒性試驗特殊毒性試驗 包括致畸、致癌、致突變作用以及生殖毒性試驗。 （1）致突變實驗包括微生物回復突變試驗、哺乳動物培養細胞染色體畸變試驗和整體試驗（常選用微核試驗）。 作用于生殖系統的藥物， 需進行動物顯性致死試驗。 （2） 致癌實驗： 短期致癌實驗和長期致癌實驗。 （3） 致畸胎試驗：于孕鼠或孕兔胚胎的器官形成期給藥，觀察對子代的影響。 最大耐受劑量最大耐受劑量(MTD) 指在外來化合物急性毒性實驗中,化學物質不引起

4、受試對象(實驗動物)出現死亡的最高劑量,故可縮寫為LD0。一般不用最大耐受劑量來比較兩種外來化合物的毒性。 治療指數治療指數 為藥物的安全性指標。通常將半數中毒量（TD50）/半數有效量（ED50)或半數致死量（LD50）/半數有效量（ED50）稱為治療指數。治療指數大的藥物相對治療指數小的藥物安全，但以治療指數來評價藥物的安全性，并不完全可靠。 安全范圍安全范圍 是指藥物的最小有效量與最小中毒量之間的范圍，它表示藥物的安全性，一般安全范圍越大，用藥越安全。藥理學用上95%有效劑量（ED95）到5%中毒劑量（LD5）的距離來表示。實驗一實驗一 急性毒性試驗急性毒性試驗 （一） 藥物LD50的測

5、定一、實驗目的一、實驗目的（1 1）理念）理念是藥三分毒是藥三分毒; ;（2 2）了解一些常規藥物毒理學的）了解一些常規藥物毒理學的試驗方法試驗方法，及及評價指標評價指標; ;（3 3）掌握藥物急性毒性試驗的）掌握藥物急性毒性試驗的試驗設計方試驗設計方法法、LDLD5050的的測定測定及及計算計算方法。方法。二二. . 實驗原理實驗原理 選擇健康的實驗動物，根據體重按隨機分組方法，選擇健康的實驗動物，根據體重按隨機分組方法，根據根據LD50LD50計算的設計原則將動物分成數個染毒組。一計算的設計原則將動物分成數個染毒組。一次或次或24h24h后，觀察動物所產生的警醒毒性反應及其嚴后，觀察動物所

6、產生的警醒毒性反應及其嚴重程度，中毒死亡的情況等，根據各組動物死亡數計重程度，中毒死亡的情況等，根據各組動物死亡數計算半數致死量（算半數致死量（LD50LD50）。據此分析受試動物毒性反應）。據此分析受試動物毒性反應與劑量的關系，并根據與劑量的關系，并根據LD50LD50值對藥物進行值對藥物進行毒性分級毒性分級。三三. .實驗材料實驗材料（1 1）器材）器材 1ml1ml注射器、電子天平、記號筆、鑷子、剪刀等。注射器、電子天平、記號筆、鑷子、剪刀等。（2 2）藥品）藥品 鹽酸賽拉嗪注射液鹽酸賽拉嗪注射液。（3 3）動物）動物 健康成年小白鼠若干只，體重健康成年小白鼠若干只，體重18-22g18

7、-22g。四四. .實驗方法實驗方法1. 預實驗預實驗各組劑量分別為各組劑量分別為Dmax、（、（ Dmax ）r、（、（ Dmax ）r2、(Dmax)r3.2.2.正式試驗正式試驗2.12.1試驗步驟試驗步驟隨機分成隨機分成5 5組組記錄小鼠死亡記錄小鼠死亡只數只數60min60min小白鼠禁小白鼠禁食食6-10h6-10h各組按試驗設各組按試驗設計方案給藥計方案給藥計算計算LDLD5050得出結論得出結論將小白鼠隨機分成將小白鼠隨機分成5 5組，每組，每 組組4 4只只( (隨機單位隨機單位組設計方法組設計方法) )。（1 1）小白鼠編號（從）小白鼠編號（從1-201-20號）用兩種顏色

8、記號）用兩種顏色記號筆進行標記：號筆進行標記：黑色代表個位（藍色記號筆）；黑色代表個位（藍色記號筆）；紅色紅色代表十位（代表十位（紅色記號筆紅色記號筆）。）。（2 2）小鼠稱重并按體重大小依次排序。）小鼠稱重并按體重大小依次排序。2.2 試驗設計試驗設計 組別組別小鼠編號小鼠編號1562112189121032013847191645131517142.3 給藥方法：肌肉注射給藥方法：肌肉注射組別組別注射濃度（注射濃度（mg/kg）注射量注射量110000.005mL/g體重體重2850372046605520表表1：給藥方案：給藥方案3.試驗結果記錄試驗結果記錄組別注射濃度（mg/kg）動物

9、數死亡數死亡率備注11000428504372044660455204表2：結果記錄表4. 計算計算LD504.14.1計算方法：計算方法：目測機率單位法目測機率單位法、加權機率單加權機率單位法位法(Bliss(Bliss 法法) )、寇氏法寇氏法、序貫法序貫法。4.24.2 BlissBliss 法法是目前推薦使用的方法。此法對是目前推薦使用的方法。此法對劑量分組無嚴格要求，不需要劑量組有劑量分組無嚴格要求，不需要劑量組有0%0%和和100%100%死亡率，是死亡率，是目前公認最準確的測定方法目前公認最準確的測定方法。4.3 4.3 我國衛生部規定，我國衛生部規定，BlissBliss法法是

10、作為是作為新藥新藥LDLD5050測定評定測定評定必須采用的方法。必須采用的方法。計算方法計算方法1：加權機率單位法加權機率單位法(Bliss(Bliss 法法)-)-軟件輔助計算軟件輔助計算計算方法計算方法2： 2. 改良寇氏法公式改良寇氏法公式計算計算： LD50=log-1Xm-i(p-0.5)Xm：為最大劑量組劑量對數值；為最大劑量組劑量對數值；i：為相鄰兩組劑量比值的對數（相鄰兩組對數劑量的差值，為相鄰兩組劑量比值的對數（相鄰兩組對數劑量的差值，log2）；）；P：為各組動物死亡率（用小數表示，如果死亡率為為各組動物死亡率（用小數表示，如果死亡率為20%應寫成應寫成0.20）；）；p

11、：各組動物死亡率之總和各組動物死亡率之總和 。5. 評價指標評價指標急性毒性分級 小鼠一次經口LD50 大致相當于體重 70kg人的致死劑量極毒1 mg/kg 10000 mg/kg 1050克6. 注意事項注意事項6.1 6.1 正確捉拿小白鼠，正確捉拿小白鼠，防止咬傷防止咬傷；6.2 6.2 注意注意肌肉注射方法肌肉注射方法，給藥劑量力求準確；，給藥劑量力求準確；6.3 6.3 實時注意觀察小鼠中毒癥狀及其發生時間、死亡實時注意觀察小鼠中毒癥狀及其發生時間、死亡時間。時間。 7. 作業作業7.1 查閱文獻，與國內外相關文獻報道結果作比較。7.2 撰寫試驗報告（二）（二） 刺激性試驗刺激性試

12、驗 1. 皮膚刺激實驗皮膚刺激實驗 2. 眼部刺激實驗眼部刺激實驗1.皮膚刺激性實驗皮膚刺激性實驗一一.實驗目的實驗目的 通過比較染毒動物與正常動物皮膚的變化，學通過比較染毒動物與正常動物皮膚的變化，學習評價外源性化學物急性皮膚刺激的習評價外源性化學物急性皮膚刺激的 基本方法。基本方法。二、實驗原理二、實驗原理 皮膚刺激試驗是指皮膚接觸藥物是否產生可逆性炎性癥狀的試驗，它又分急性皮膚刺激試驗（一次皮膚涂抹實驗）和多次皮膚刺激試驗。 所有皮膚刺激試驗方法都在Draixe, Waodard和Calvery(1944）所提方法的基礎上發展起來的。目前多選用家兔和豚鼠，對于強刺激或無刺激作用的藥物用家

13、兔檢測效果好，但對作用緩和的刺激藥物用豚鼠實驗結果較準確。Criffth（1977）發現家兔通常比豚鼠和人更易敏感，用這兩種動物評價人體反應更為合理。三、實驗材料三、實驗材料 1、動物：成年健康家兔。家兔休重2kg左右，與給受試物24小時將動物背部脊柱兩側毛脫掉，脫毛面積約為體表面積1（家兔每側各約50cm2）。 2、受試物：膏劑、液體或粉末。粉末需用適宜賦形劑（如羊毛脂、凡士林等）混勻，本實驗采用10%雙氧水溶液。四、實驗方法四、實驗方法 1、實驗操作：在家兔背部受試物區和對照區（脫毛后），一次將受試物1ml均勻涂布受試物區，將生理鹽水涂布于空白對照區，再以醫用紗布及膠布進行包扎固定，開始計

14、時。在給藥后30分鐘取下包扎，用溫水洗凈皮膚上的殘留受試物，觀察受試區皮膚的變化，有無紅斑、水腫等現象。 如為多次給受試物實驗則一般每日涂抹一次，連續一周，其余均與一次給受試物的方法和要求一致。 2、結果判斷與評價 每只動物實驗結果按表1進行刺激反應評分，計算出平均分值按表2進行刺激強度評價：紅斑形成積分無紅斑0勉強可見1明顯紅斑2中等-嚴重紅斑3紫紅色紅斑并有焦痂形成4水腫形成無水腫0勉強可見1皮膚隆起輪廓清楚2水腫隆起約1mm3水腫隆起超過1mm，范圍擴大4總分8表表1 皮膚刺激反應評分皮膚刺激反應評分表表2 皮膚刺激強度評價皮膚刺激強度評價刺激反應分值無刺激0-0.4輕度刺激0.5-2.

15、9中度刺激3-5.9強刺激6.0-8.02. 眼刺激試驗眼刺激試驗一一. .試驗目的試驗目的 1. 1.眼刺激試驗目的；眼刺激試驗目的； 2. 2.眼刺激試驗方法；眼刺激試驗方法； 3. 3.眼刺激試驗結果的評價方法。眼刺激試驗結果的評價方法。1.1.動物：家兔；動物：家兔；2.2.受試物：受試物：10%10%雙氧水溶液雙氧水溶液；3.3.劑量：滴入劑量：滴入1 1滴滴；4.4.方法：方法：滴入滴入一側眼一側眼結膜囊內結膜囊內，另一側作為空白對照（滴入，另一側作為空白對照（滴入等量生理鹽水）。給藥后使眼睛等量生理鹽水）。給藥后使眼睛被動閉合被動閉合1min1min。記錄給藥后。記錄給藥后5mi

16、n5min、10min10min、15min15min、20min20min時眼的局部反應情況（時眼的局部反應情況（1h1h、12h12h、24h24h、48h48h、72h72h）。）。二、實驗材料二、實驗材料眼睛部分結構：模式圖眼睛部分結構：模式圖眼刺激試驗-角膜評分刺激反應強度評分無混濁 0極輕微彌漫性混濁，虹膜清晰可見 1輕度混濁（虹膜細微結構不清晰）2混濁（虹膜結構不清，瞳孔大小看不到）3極混濁（虹膜完全看不到）4眼刺激試驗虹膜評分 刺激反應強度刺激反應強度 評分評分 正常正常 0皺褶明顯加深，充血充血，腫脹腫脹，角膜周圍輕度充血，瞳孔對光仍有反應瞳孔對光仍有反應 1出血出血，肉眼可

17、見壞死壞死，對光無反應對光無反應（或出現其中一種反應） 2眼刺激試驗結膜評分. 充血（指瞼結膜、球結膜部位）充血（指瞼結膜、球結膜部位） 評分評分 血管正常血管正常 血管充血呈血管充血呈鮮紅色鮮紅色 血管充血呈血管充血呈深紅色深紅色，血管不易分辨，血管不易分辨 彌漫性充血呈彌漫性充血呈紫紅色紫紅色 . 水腫水腫 無水腫無水腫 輕微水腫輕微水腫（包括瞬膜）（包括瞬膜） 明顯水腫，伴有明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻部分眼瞼外翻 水腫至水腫至眼瞼近半閉合眼瞼近半閉合 水腫至水腫至眼瞼超半閉合眼瞼超半閉合 . 分泌物分泌物 無分泌物無分泌物 少量分泌物少量分泌物 分泌物使分泌物使眼瞼和睫毛潮濕眼瞼和睫毛潮

18、濕或粘著或粘著 分泌物使整個分泌物使整個眼區潮濕眼區潮濕或粘著或粘著 分值計算方法分值計算方法角膜評分：分值虹膜評分：分值結膜評分：（）分值總分：項評分之和。分值范圍（分） 眼刺激性評價標準 刺激程度刺激程度 積積 分分無刺激性無刺激性 5 5輕度刺激性輕度刺激性 輕度刺至中度刺激性 中度刺激性中度刺激性 中度至重度度刺激性 重度刺激性重度刺激性 作業作業撰寫試驗報告。實驗二實驗二 特殊毒性試驗特殊毒性試驗 特殊毒性包括致畸、致癌、致突變作用和生殖毒性。 藥物對遺傳物質的損傷,被稱為“藥物的遺傳毒性”。若藥物影響生殖細胞使形成的配子(精子和卵)的遺傳物質發生突變,可能致使發育期間的胎兒發生先天

19、性畸形。突變如發生在體細胞,在個體中可導致腫瘤的形成。藥物的致癌性,致畸性,致突變性都是屬于藥物特殊毒性的研究范圍。三者之間關系交錯癌變與突變,致癌物與致突變物有著密切的關系。1.1.小鼠骨髓微核試驗小鼠骨髓微核試驗2.2.藥物免疫毒性試驗（藥物免疫毒性試驗（環磷酰胺環磷酰胺對小鼠免疫器官重對小鼠免疫器官重量的影響）量的影響）1. 1. 小鼠骨髓微核試驗小鼠骨髓微核試驗學習小鼠骨髓微核試驗原理及目的學習小鼠骨髓微核試驗原理及目的 掌握微核試驗的制片方法掌握微核試驗的制片方法 掌握微核的觀察計數掌握微核的觀察計數 掌握微核試驗的結果分析評價掌握微核試驗的結果分析評價4 41 12 23 3一一.

20、 試驗目的試驗目的 微核試驗（MNT）是檢測染色體或有絲分裂期損傷的一種遺傳毒性試驗方法。無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期仍留在子細胞的胞質內成為微核。 最常用的是嚙齒類動物骨髓嗜多染紅細胞(PCE)微核試驗。以受試物處理嚙齒類動物，然后處死，取骨髓，制片、固定、染色，于顯微鏡下計數PCE中的微核。如果與對照組比較，處理組PCE微核率有統計學意義的增加，并有劑量-反應關系，則可認為該受試物是哺乳動物體細胞的致突變物。二二.實驗原理實驗原理微微 核（核（micronucleus, 簡稱MCN） 微核微核是在細胞的有絲分裂后期染色體有規律地進入子細胞形成細胞核時

21、，仍然留在細胞質中的留在細胞質中的染色染色單體單體或或染色體染色體的無著絲粒的無著絲粒片斷或環片斷或環。最后單獨形成一個或幾個規則的次核次核，存在于細胞質中，由于比比核小得多故稱核小得多故稱微核微核。 微核的產生與微核的產生與染色體損傷染色體損傷有關。有關。 也叫衛星核衛星核,是真核類生物細胞中的一種異常結構,是染色體畸變在間期細胞中的一種表現形式。微核試驗微核試驗(Micronucleus test，MNT) 通過試驗通過試驗觀察受試動物是否產生微核的試驗。從而判斷受試動物是否發生突變突變（測試干擾有絲分裂干擾有絲分裂的物質）。 微核微核可出現在多種細胞中多種細胞中，但在有核細胞 中較難與正

22、常核的分支相區別，由于紅細胞在成熟前最后一次分離后數小紅細胞在成熟前最后一次分離后數小時可將主核排出，而仍保留微核于時可將主核排出，而仍保留微核于嗜多染紅細胞（嗜多染紅細胞（PCEPCE）中中，而且在骨髓中骨髓中微核形成達到高峰。因此，通常計數骨髓中骨髓中PCEPCE細胞中的微核數細胞中的微核數作為判斷指標判斷指標。 PCE（polychromatic erythrocyte）指嗜多染紅細胞， NCE（normochromatic erythrocyte）指正染紅細胞， RBC（red blood cell）指紅細胞，包括PCE和NCE。 PCENCE為評價細胞毒性的指標，代表未成熟紅細胞與成

23、熟紅細胞的比值。微核試驗中計算PCENCE比值時，每只動物應至少計數200個紅細胞（即：PCE+NCE200個）。微核試驗中未成熟紅細胞占總紅細胞的比值不應少于對照組的20。三三. 實驗器材及試劑實驗器材及試劑器材器材 手術刀、手術剪、干凈紗布、玻璃染色缸、1ml注射器、6號針頭、載玻片、帶油鏡頭顯微鏡。試劑試劑小牛血清、Giemsa應用液、 二甲苯。實驗動物：實驗動物：昆明小白鼠四四.試驗動物處理試驗動物處理1 試驗分組試驗分組 模型組：用1%1%環磷酰胺環磷酰胺按按0.1ml/10g(100mg/kg)0.1ml/10g(100mg/kg)劑量進行經口染毒兩次，間隔24h； 空白對照組：

24、灌服等量生理鹽水生理鹽水；2、采樣制片、采樣制片（1 1）骨髓液的制備和涂片）骨髓液的制備和涂片 試驗動物用頸椎脫臼頸椎脫臼的方法將其處死處死，剖開后肢取下股骨股骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去兩端骨骺。用1ml注射器接6號針頭吸取約0.05ml小牛血清，沖洗骨髓腔沖洗骨髓腔1-2次，沖洗物用潔凈載玻片接著，混合均勻混合均勻后推片，晾干晾干（可用酒精燈短時烘烤加快晾干速度）。 涂片 滴加一滴于載玻片上，再取一張載玻片30勻速滑動（2）固定與染色）固定與染色1 1）. . 固定：固定：將推好晾干的骨髓片用甲醇固定甲醇固定5-5-10min10min取出晾干。2 2）. . 染色：染色：將固定晾干后的

25、涂片、用新鮮配制的GiemsaGiemsa應用液應用液(Giemsa儲備液1份加pH6.4的磷酸鹽緩沖液9份)染色染色10-15min10-15min，然后沖洗沖洗掉玻片上的染色液，晾干。 3、觀察、觀察 先在低倍鏡下觀察，選擇分布及染色較好的區域，再在油鏡下觀察計數。1.嗜多染紅細胞(PCEPCE)呈灰藍色灰藍色(未成熟紅細胞)；2.正染紅細胞(NCENCE)呈粉紅色粉紅色(成熟紅細胞)；3.觀察PCE細胞中的微核(MNMN)(微核多數呈圓形圓形，邊緣光滑光滑整齊整齊，呈紫紅色或藍紫色紫紅色或藍紫色)4、計數、計數1）.計數200200個個RBCRBC(PCE+NCE)得出PCE與NCE的比

26、值 PCE/NCEPCE/NCE比值比值= PCE= PCE個數個數/NCE/NCE個數個數2）.計數10001000個個PCEPCE細胞得出含有微核的PCE細胞個數。 微核率微核率= =（含微核（含微核PCEPCE個數個數/ /計數計數PCEPCE總數）總數）10001000 結果以千分率表示。結果以千分率表示。實驗記錄實驗記錄計算各組微核細胞率計算各組微核細胞率結果分析與評價結果分析與評價PCE/NCEPCE/NCE比值：比值：正常的正常的PCE/NCEPCE/NCE比值約為比值約為1 1( (正常范圍為正常范圍為0.6-0.6-1.21.2) )試驗組：如比值試驗組：如比值 0.10.1

27、X X0.60.6, ,表示受到表示受到PCEPCE形成受到形成受到不同程度抑制不同程度抑制; ;如比值如比值0.050.05X X0.10.1，則表示，則表示PCEPCE形成形成受到受到嚴重抑制嚴重抑制；比值；比值0.050.05，表示受試化學毒物的，表示受試化學毒物的劑量過大劑量過大，試驗結果不可靠試驗結果不可靠。注意事項注意事項1.做好推片推片和控制好染色時間染色時間是試驗成敗的關鍵。2.顯微鏡在油鏡油鏡下觀察，使用完后需用擦鏡紙沾取少量二甲苯進行擦洗二甲苯進行擦洗。2. 免疫毒性試驗免疫毒性試驗一、實驗目的一、實驗目的 通過比較染毒動物與正常對照動物胸腺和脾臟的大通過比較染毒動物與正常對照動物胸腺和脾臟的大小和重量差異，學習評價小和重量差異，學習評價 藥物對動物免疫器官毒性的藥物對動物免疫器官毒性的基本方法。基本方法。 二、基本原理二