1、實驗實驗2 2 分離分離以尿素為氮以尿素為氮 源的源的微生物微生物分離微生物的方法分離微生物的方法: :劃線分離法劃線分離法涂布分離法涂布分離法選擇培養基培養法選擇培養基培養法尿素又稱脲尿素又稱脲, ,是蛋白質的降解產物是蛋白質的降解產物, ,哺乳動哺乳動物的尿液中含有物的尿液中含有, ,植物不能直接吸收尿素植物不能直接吸收尿素, ,因此因此, ,大量尿素的存在對環境造成污染大量尿素的存在對環境造成污染. .有有些細菌可產生些細菌可產生脲酶脲酶, ,以尿素為氮源以尿素為氮源, ,脲酶可脲酶可將尿素分解為氨將尿素分解為氨, ,被植物吸收被植物吸收. .一、實驗原理一、實驗原理 用用選擇培養基選擇

2、培養基可分離出以尿素為氮源的微生可分離出以尿素為氮源的微生物，這些微生物可產生物，這些微生物可產生脲酶脲酶，脲酶可將尿素，脲酶可將尿素分解為能被植物吸收的氨，因此這類微生物分解為能被植物吸收的氨，因此這類微生物具有一定的生態學價值。具有一定的生態學價值。稀釋涂布分離法稀釋涂布分離法統統計土壤樣品中含有的這種微生物的數目計土壤樣品中含有的這種微生物的數目 細菌細菌 尿素尿素 NH3 中性中性 堿性堿性 酚紅顏色：酚紅顏色： 黃色黃色 紅色紅色二、實驗目的二、實驗目的: : 使用以尿素為唯一氮源的培養基分離細菌使用以尿素為唯一氮源的培養基分離細菌( (有有脲酶脲酶) ) 通過指示劑（酚紅）顏色的變

3、化檢知培養基通過指示劑（酚紅）顏色的變化檢知培養基pHpH的變化的變化( (脲酶催化的化學反應脲酶催化的化學反應) ) 統計被檢測的土壤中含有的以尿素為氮源的微生統計被檢測的土壤中含有的以尿素為氮源的微生物的數量物的數量三、實驗用品和材料：三、實驗用品和材料： 尿素培養基（尿素培養基（25mL） 葡萄糖葡萄糖 0.025g NaCl 0.12g K2HPO4 0.12g 瓊脂糖瓊脂糖 0.5g 酚紅酚紅 0.25mg 尿素尿素 10mL溶液溶液 （內含（內含2g脲）脲） 水：水： 15mL LB培養基（培養基（25mL） 蛋白胨：蛋白胨： 0.25g 酵母粉：酵母粉： 0.12g NaCl：

4、0.25g 瓊脂糖：瓊脂糖： 0.5g 水：水： 25mL 對照組對照組選擇培養基選擇培養基實驗組實驗組、制備無菌的固體培養基和尿素固體培養基、制備無菌的固體培養基和尿素固體培養基四、操作步驟：四、操作步驟： 過濾滅菌后的過濾滅菌后的尿素尿素2、倒平板、倒平板 至少需要倒至少需要倒2個個LB固體培養基，固體培養基，6個尿素固體培養基個尿素固體培養基LB(對照)尿素10-410-5每個稀釋度每個稀釋度 1個個LB對照平板對照平板 3個尿素平板個尿素平板(平行重復組平行重復組)1個個99ml無菌水無菌水 2個個4.5ml無菌水無菌水得得10-2, 10-3,10-4,10-5的菌懸液的菌懸液1g土

5、壤土壤、制備一定濃度梯度的細菌懸液：、制備一定濃度梯度的細菌懸液：g土壤土壤ml無菌水，振蕩，為無菌水，振蕩，為-稀釋液，稀釋液，依次制備依次制備-、-、-的土壤稀釋液。的土壤稀釋液。接種 取100ul菌懸液、涂布分離法分離細菌、涂布分離法分離細菌（無菌，0.1ml，玻璃刮刀）涂布分離涂布分離涂布前后三角刮刀需要灼燒嗎？涂布前后三角刮刀需要灼燒嗎？ 涂布平板的所有操作都應在火焰附近涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第操作要求，想一想，第2 2步應如何進行無步應如何進行無菌操作？菌操作？ 應從操作的各個細節保證應

6、從操作的各個細節保證“無菌無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。在酒精燈火焰周圍等等。37倒置培養按濃度捆成一摞按濃度捆成一摞恒溫恒溫37培養培養、培養觀察（倒置，度）、培養觀察（倒置，度）恒溫恒溫37培養培養LB培養基上培養基上10-2、10-3、10-4 、10-5稀釋度土樣涂布結果稀釋度土樣涂布結果尿素培養基上尿素培養基上10-2、10-3、10-4 、10-5稀釋度土樣涂布結果稀釋度土樣涂布結果操作步驟：（學生做）操作步驟：（學生做）、倒平板：、倒平板：倒個培

7、養基，個尿素固體培養基倒個培養基，個尿素固體培養基、制備一定濃度梯度的細菌懸液：、制備一定濃度梯度的細菌懸液：g土壤土壤ml無菌水，振蕩，為無菌水，振蕩，為-稀釋液，依次稀釋液，依次制備制備-、-、 -5 （.ml無菌水）無菌水）的土壤稀釋液。的土壤稀釋液。、稀釋涂布分離法分離細菌、稀釋涂布分離法分離細菌、制備無菌的固體培養基和尿素固體培養基制備無菌的固體培養基和尿素固體培養基、培養觀察（倒置，度）、培養觀察（倒置，度）五、實驗中涉及到的一些問題：五、實驗中涉及到的一些問題：（一）哪些土壤中含有這種以尿素為氮源的微生物多？（一）哪些土壤中含有這種以尿素為氮源的微生物多？（選材的問題）（選材的問

8、題）（二）此實驗用到的選擇培養基必需含有哪些物質？（二）此實驗用到的選擇培養基必需含有哪些物質？（三）可用什么指標認定不同土壤中選擇出的微生物（三）可用什么指標認定不同土壤中選擇出的微生物對尿素分解能力的高低？對尿素分解能力的高低？（四）統計微生物的數量可用哪些方法？（四）統計微生物的數量可用哪些方法？沒硬化，腐殖質豐富的土壤沒硬化，腐殖質豐富的土壤（從有哺乳動物排泄物的地方取得）（從有哺乳動物排泄物的地方取得）碳源、尿素、無機鹽、水、酚紅碳源、尿素、無機鹽、水、酚紅培養基紅色的深淺培養基紅色的深淺涂布分離法，顯微鏡直接記數法涂布分離法，顯微鏡直接記數法（五）用稀釋涂布分離法計數時，菌落數在（

9、五）用稀釋涂布分離法計數時，菌落數在30-30030-300的計數。的計數。重復性原則重復性原則對照原則對照原則（排除實驗組中非測試因素對實驗結果的（排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗的可信度）影響，提高實驗的可信度）做一系列濃度梯度實驗，探究合適的稀釋度做一系列濃度梯度實驗，探究合適的稀釋度（六）實驗設計要遵循的原則：（六）實驗設計要遵循的原則：練習題練習題1 1、選擇培養基：在微生物學中，將允許、選擇培養基：在微生物學中，將允許 種類的微生物種類的微生物生長，同時生長，同時 和和 其他種類微生物生長的培養基，稱作其他種類微生物生長的培養基，稱作選擇培養基。選擇培養基。 阻止阻

10、止 特定特定抑制抑制2 2、常用稀釋涂布平板法來統計樣品中活菌的數目。當樣品、常用稀釋涂布平板法來統計樣品中活菌的數目。當樣品的的 足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個于樣品稀釋液中的一個 。通過統計平板上的菌落數，。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結果準確，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結果準確，一般選擇菌落數在一般選擇菌落數在 的平板進行計數。此外，測定的平板進行計數。此外，測定微生物數量的常用方法還有微生物數量的常用方法還有 直接計數。直接計數。 顯微鏡顯微鏡 稀釋度稀釋度細菌細

11、菌30-30030-3003 3、在同一稀釋度下，至少對、在同一稀釋度下，至少對3 3個平板進行重復計數，然后個平板進行重復計數，然后求出求出 ，并根據平板所對應的稀釋度計算出樣品中，并根據平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數目。細菌的數目。 平均數平均數 4 4、用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數，在對應稀、用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為釋倍數為1010-6-6的培養基中得到以下幾種統計結果，正確的是的培養基中得到以下幾種統計結果，正確的是 A A涂布了一個平板，統計的菌落數是涂布了一個平板，統計的菌落數是230230 B B涂布了兩個平板，統計的菌落

12、數是涂布了兩個平板，統計的菌落數是215215和和260260，取平均值，取平均值238238 C C涂布了三個平板，統計的菌落數分別是涂布了三個平板，統計的菌落數分別是2121、212212和和256256，取，取平均值平均值163163 D D涂布了三個平板，統計的菌落數分別是涂布了三個平板，統計的菌落數分別是2l02l0、240240和和250250，取，取平均值平均值233233D 5.5.在做分離分解尿素的細菌實驗時，在做分離分解尿素的細菌實驗時，A A同學從對應同學從對應1010-6-6培養基上培養基上篩選出大約篩選出大約150150個菌落，而其他同學只選擇出大約個菌落，而其他同學

13、只選擇出大約5050個菌落。個菌落。A A同學的結果產生原因可能有同學的結果產生原因可能有( )( ) 由于土樣不同由于土樣不同 由于培養基污染由于培養基污染 由于操作失誤由于操作失誤 沒有設置對照沒有設置對照 A A B B C C D DA 兩位同學分別用稀釋涂布法測定同一土壤樣品中的細菌數在兩位同學分別用稀釋涂布法測定同一土壤樣品中的細菌數在對應稀釋倍數為對應稀釋倍數為-的培養基中，得到以下兩種統計結果的培養基中，得到以下兩種統計結果第一個同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌落數為第一個同學在該濃度下涂布了一個平板，統計的菌落數為第二個同學在該濃度下涂布了三個平板，統計的菌落數分第二個

14、同學在該濃度下涂布了三個平板，統計的菌落數分別為、和。該同學以這三個平板上菌落數的別為、和。該同學以這三個平板上菌落數的平均值作為統計結果。平均值作為統計結果。你認為這兩位的同學需要改進嗎？如果需要，如何改進？你認為這兩位的同學需要改進嗎？如果需要，如何改進？第一位同學只涂布了一個平板，沒有設置重復組，因此結果不具有說服力。第一位同學只涂布了一個平板，沒有設置重復組，因此結果不具有說服力。第二位同學考慮到設置重復組的問題，但是，其中第二位同學考慮到設置重復組的問題，但是，其中1 1個平板的計數結果與另個平板的計數結果與另2 2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現了錯誤，因此，不能簡單地將個相差太遠，說明在操作過程中可能出現了錯誤，因此，不能簡單地將3 3個平板的計數值用來求平均值個平板的計數值用來求平均值 。在設計實驗時，一定要涂布至在設計實驗時，一定要涂布至少少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性準確性 兩位同學分別用稀釋涂布法測定兩位同學分別用稀釋涂布法測定同一土壤同一土壤樣品中的樣品中的細菌數同學篩選出大約個菌落，但是，細菌數同學篩選出大約個菌落，但是，同學在同樣稀釋度下只獲得個菌落。同學在同樣稀釋度下只獲得個菌落。同學認為的