1、分子生物學(xué)在微生物檢驗中的應(yīng)用南京軍區(qū)福州總醫(yī)院全軍臨床檢驗研究所蘭小鵬21 世紀是以分子生物學(xué)為代表的生命科學(xué)的時代，近年來,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展,人類基因組計劃的完成,尤其是生物化學(xué)、免疫學(xué)、生物儀器及計算機理論與技術(shù)的進步，分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等各個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用, 新的診斷技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn)并被廣泛應(yīng)用于微生物檢測，為傳染病的流行病學(xué)調(diào)查、基因的多樣性、微生物的生物學(xué)特性、 微生物的致病性和藥物的耐受性、微生物的生物降解能力等各個方面提供了重要的信息。一核酸雜交法最初應(yīng)用于微生物檢測的分子生物學(xué)技術(shù)是基因探針方法,它是用帶有同位素標記或非同位素標記的DNA

2、或 RNA 片段來檢測樣本中某一特定微生物核苷酸的方法。核酸雜交有原位雜交、打點雜交、斑點雜交、Sorthern 雜交、 Northern 雜交等 ,核酸分子探針又可根據(jù)它們的來源和性質(zhì)分為DNA探針、 cDNA探針、RNA探針及人工合成的寡聚核苷酸探針等。其原理是通過標記根據(jù)病原體核酸片段制備的探針與病原體核酸片段雜交,觀察是否產(chǎn)生特異的雜交信號。核酸探針技術(shù)具有特異性好、敏感性高、診斷速度快、操作較為簡便等特點。目前, 已建立了多種病原體的核酸雜交檢測方法,尤其是近年來發(fā)展起來的熒光原位雜交技術(shù)(FISH) 更為常用。二質(zhì)粒DNA圖譜分型技術(shù)細菌質(zhì)粒分析是較早被使用的對病原微生物流行病學(xué)進

3、行調(diào)查的分子分型技術(shù)。這種技術(shù)包括萃取質(zhì)粒DNA , 通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA。由于不同菌株質(zhì)粒DNA序列和大小不同,通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的DNA 質(zhì)粒圖譜也將不同,因此,與流行病相關(guān)的分離株能夠被分類分型。 質(zhì)粒圖譜分析的再現(xiàn)性和分辨力可通過限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒而提高。雖然 2個不相關(guān)質(zhì)粒有相同的分子量, 但性內(nèi)切酶位點的位置和頻率是不同的。但質(zhì)粒是可移動的非染色體遺傳物質(zhì),細菌能自發(fā)的失去或很容易的獲得,結(jié)果流行病相關(guān)的菌株可以展示不同質(zhì)粒指紋圖譜。許多質(zhì)粒帶有抗性決定因子的基因, 存在于轉(zhuǎn)位子上,而轉(zhuǎn)位子很容易丟失或獲得,這同樣可以迅速改變質(zhì)粒DNA組成。 產(chǎn)生圖譜的再現(xiàn)性也會

4、由于質(zhì)粒空間存在的不一致性（超螺旋的、斷口的和線形的）而被影響,而凝膠電泳時具有不同遷移速度。大多數(shù)病原微生物有質(zhì)粒,但沒有質(zhì)粒的就不能用此技術(shù)分型。此外,由于有些分離株中含有1 個或 2個質(zhì)粒,會使菌株間的分辨力降低。三染色體DNA 限制性內(nèi)切酶分析技術(shù)染色體 DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化,消化后的片段再通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離。用限制性內(nèi)切核酸酶Bgl 和 EcoRI 等消化病原微生物基因組DNA 可以產(chǎn)生大量短的片段。電泳后,將獲得一系列被分離的DNA圖譜。 通過比較圖譜,就可以進行菌相似性研究。幾乎所有的病原微生物分離株都可以通過這種方法分型,但由于基因組DNA巨大,酶切后產(chǎn)生的片段

5、眾多,且含有大量的重疊片段,這將導(dǎo)致菌株間圖譜一致性分析產(chǎn)生困難。但若細菌只含一個或少量核糖體操縱子,則只產(chǎn)生12條帶 , 這限制區(qū)分密切相關(guān)菌株的能力。RFLP 分析分辨力低于脈沖場凝膠電泳分型技術(shù)（PFGE ） , 且比較復(fù)雜圖譜（數(shù)百條帶） 的難度較大。四 DNA 的脈沖場凝膠電泳分型技術(shù)脈沖場凝膠電泳分型技術(shù)（PFGE ）是使用對染色體有很少酶切位點的限制性核酸內(nèi)切酶消化細菌DNA , 產(chǎn)生大的DNA片段（10 800 kb） , 這些大片段不能通過常規(guī)電泳方法進行有效分離。在電場方向周期改變（脈沖）的凝膠電泳條件下,DNA 片段根據(jù)大小有效分離。PFGE 產(chǎn)生的染色體 DNA圖譜比用

6、那些高頻率切割的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的圖譜更為簡單清晰。理論上,所有的細菌都能使用PFGE 進行分型分類,結(jié)果具有極高的再現(xiàn)性和分辨率, 常作為分子生物學(xué)分型方法的“金標準”使用。 PFGE 也有一些局限,例如所需時間長,使用的試劑非常昂貴,要求專門的儀器等。 另外,很小的電泳條件的不同就可以改變每條光譜帶間距離,使用不同凝膠進行電泳得到的結(jié)果也比較復(fù)雜,這為不同實驗室間的結(jié)果比較帶來一定麻煩。五聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)( PCR) 技術(shù)自 1985 年發(fā)明以來,因其高度靈敏性和良好的特異性受到了人們的高度重視,各種各樣以PCR 為基礎(chǔ)的DNA序列的擴增和檢測方法得到了迅猛發(fā)展,幾乎已應(yīng)用于基

7、礎(chǔ)研究的各個領(lǐng)域。各種衍生技術(shù)如反轉(zhuǎn)錄PCR ( RTR) 、 多重 PCR 、 巢式PCR 、 PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCRSSCP) 、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP )、隨機擴增的多態(tài)性DNA 技術(shù) (RAPD) 和重復(fù)序列PCR 技術(shù) (Rep - PCR) 、熒光定量PCR 等。其中定量PCR 既可以用于臨床感染性疾病的診斷,又可用于監(jiān)測其療效，PCR 及其衍生的技術(shù)近年來在病原微生物分型研究上得到了廣泛應(yīng)用。1 . 隨機擴增的多態(tài)性DNA 技術(shù)隨機擴增的多態(tài)性DNA 技術(shù)( RAPD )是一種典型PCR 衍生技術(shù), 在低復(fù)性溫度下用短任意序列引物( 10 15m ers) 擴增有密

8、切同源性的基因組DNA序列 , 模板上任意引物雜交點的數(shù)目和位置因種的不同株而異, 理論上特定株形成特定圖譜。基因組在這些雜交區(qū)段如發(fā)生了DNA片段缺失、插入或堿基突變,就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點分布發(fā)生相應(yīng)的變化。通過電泳對擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性進行檢測、分析就可以反應(yīng)出不同菌株基因組的DNA特點,從而對他們進行分型，RAPD 是目前最簡單的DNA分型方法, 分辨力高于RFLP, 但低于 Rep PCR ，RAPD 技術(shù)的使用范圍也非常廣,分辨結(jié)果也有較好的實驗室再現(xiàn)性。雖然RAPD 技術(shù)簡單、快速 , 但由于其對引物和DNA濃度、 DNA模板質(zhì)量、凝膠電泳和DNA聚合酶類型的變化高度敏

9、感故 RAPD 的重復(fù)性不夠理想。雖然 RAPD 的分型結(jié)果在不同實驗室間變化較大,分辨力不如PFGE技術(shù) ,但在疾病暴發(fā)流行時,PAPD 仍是一種分析相關(guān)菌株和排除不相關(guān)菌株的良好技術(shù)。2 .重復(fù)序列PCR技術(shù)重復(fù)序列PCR 技術(shù) ( Rep PCR 是利用細菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列為引物靶序列進行 PCR擴增,通過對PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果的比較,分析菌株間基因組存在的差異。這些重復(fù)序列在原核生物界廣泛存在,在一些細菌屬和種中是保守的。在這種方式獲得的圖譜中,光譜帶的大小和數(shù)量的不同代表著不同菌株重復(fù)序列間的距離和重復(fù)序列的數(shù)量。已成功地用于分型的細菌重復(fù) DNA序列有腸道菌重復(fù)基因間共

10、有(ERIC) 序列、 重復(fù)基因外回紋序列(REP) 和 BOX序列的分析，與其他分類技術(shù)相比,這種技術(shù)有更高的分辨力。研究表明,雖然有時Rep-PCR 分辨力稍低 , 但與 PFGE 獲得的結(jié)果卻有很好的相關(guān)性。3 .免疫 PCR免疫 PCR(immuno polymerase chain reaction ,IM PCR) 是 1992 年 Sano 等建立的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術(shù)。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機結(jié)合在一起,它的基本原理是用一段已知DNA分子標記抗體作為探針,用此探針與待測抗原反應(yīng) , 用 PCR擴增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA 分

11、子,電泳定性,根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的有無,來判斷待測抗原是否存在。目前,國內(nèi)外報道的免疫PCR 的敏感性一般比現(xiàn)行的ELISA 法高 102 105 倍。 由于 PCR 產(chǎn)物在抗原量未達到飽和前與抗原抗體復(fù)合物的量成正比,因此免疫PCR 還可用于抗原的半定量試驗。PCR ELISA是 PCR與 ELISA技術(shù)結(jié)合的檢測方法，其綜合了PCR 、分子雜交和ELISA三種技術(shù)的優(yōu)點，主要用于檢測樣品中的特定基因。它引入地高辛(或生物素) 標記的 dNTP 或引物進行 PCR擴增 ,利用酶標抗地高辛抗體(或酶標記親和素) 進行 ELISA 檢測 ,代替了用于常規(guī)PCR產(chǎn)物檢測的電泳方法,方便快捷,易于

12、處理大量樣品,且其靈敏度比使用瓊脂糖凝膠電泳檢測方法高 100 倍 ,當有適當?shù)臉藴势窌r,還可進行定量測定。六 DNA 序列測定與檢測全染色體的PFGE 、 Rep PCR 和 RAPD 分析相比,DNA 測序只檢測細菌或真菌株間潛在變化序列的很小一部分。用于辨別菌株的被測序DNA 區(qū)域必須滿足以下條件:DNA 區(qū)的結(jié)構(gòu)必須是可變序列，兩側(cè)為高度保守區(qū);DNA序列的可變性必須能足以區(qū)分特定種的不同株;DNA序列不能水平轉(zhuǎn)移到其它株。對細菌和真菌, 極少序列滿足這些條件。相反,DNA測序被認為是病毒分型的 “金標準” 。 DNA測序費用高、需要很高的技術(shù)條件, 而且自動化DNA 測序儀十分昂貴。

13、七基于16SrRNA 的檢測技術(shù)自 Woese 等于 1987年首次運用rRNA 分析以來,rRNA數(shù)據(jù)庫快速擴大起來,成為研究細菌多樣性、進化、系統(tǒng)發(fā)育中被廣泛采用的序列。16SrRNA 存在于所有原核生物細胞中,它們相對穩(wěn)定且有較高的拷貝數(shù)（每個細胞幾千個拷貝） , 其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū),因此可設(shè)計群、屬、種特異性的探針。現(xiàn)階段各種常見細菌的16SrRNA 基因幾乎全部測序完成,16S rRNA 編碼基因的這些特點使之成為較理想的細菌基因分類的靶序列,逐漸成為細菌鑒定、分類的“金標準”。目前 , 16SrRNA 檢測技術(shù)已在醫(yī)學(xué)界得到廣泛應(yīng)用,可以用現(xiàn)有病原菌標準菌株制作DGGE（

14、 變性梯度凝膠電泳） 標準 marker , 然后對疑似“病原菌”擴增 16SrRNA 進行 DGGE 分析 ,這樣可以做到快速檢測。八 生物芯片生物芯片技術(shù)是將生物大分子,如寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如硅片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質(zhì)上形成生物分子點陣, 當待測樣品中的生物分子與生物芯片的探針分子發(fā)生雜交或相互作用后,利用激光共聚焦顯微掃描儀對雜交信號進行檢測和分析。微生物檢測基因芯片是指用來檢測樣品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片。基于高通量、微型化和平行分析的特點, 微生物檢測基因芯片在微生物病原體檢測、種類鑒定、功能基因檢測、基因分型、突

15、變檢測、基因組監(jiān)測等研究領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用。 目前,許多細菌、病毒等病原體的基因組測序已經(jīng)完成,將許多代表各種微生物的特殊基因制成1 張芯片,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄就可檢測樣本中有無病原體基因的表達及表達水平,由此判斷病人感染病原、感染進程以及宿主反應(yīng)等。這樣就大大提高了檢測效率。基因芯片診斷病原菌的原理基于細菌的 16SrRNA 基因的高度保守性,由于RNA 易于降解,因此多采用檢測16SrRNA 所對應(yīng)染色體上的 16SrDNA 序列。對16SrDNA 而言,如果出現(xiàn)3 個堿基以上的差異就可以斷定細菌不屬于,因此可用于細菌的分類和鑒別。對病毒和耐藥性病原菌的檢測是通過將待測的特定基因 ( 病毒

16、特異性基因和耐藥基因) 經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、PCR 、逆轉(zhuǎn)錄、末端標記等處理成標記有熒光分子的核酸分子, 然后與芯片上的探針進行雜交, 用計算機對雜交信號進行處理,依信號和強度即可得出核酸含量。液態(tài)芯片(Suspension Array Technology ， SAT ) ，又稱微球蛋白芯片(Protein Bead arrays ，PBA) ，是近年來出現(xiàn)的一種新的芯片技術(shù)，也是唯一被美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的用于臨床診斷的生物芯片。其原理是用兩種熒光染料按照不同比例將直徑為5.6um 的微球( beads/microfluorospheres )染成 100種染色，每種顏色的微球共

17、價結(jié)合一種生物探針，可以是抗原、抗體、配體，也可以是核酸或酶，分別針對一種待檢物。混合載有100 種不同顏色的微球，就可以在一個反應(yīng)孔里同時完成100 種不同的生物反應(yīng)。隨后微球成單列通過兩束激光照射的管道，計算機采集并處理每種顏色微球的熒光強度變化就可以分別對每個待測物進行定性或定量的檢測，該系統(tǒng)可用于多種微生物抗原、抗體和特定基因的聯(lián)合檢測，與固態(tài)芯片相比，液態(tài)芯片在反應(yīng)動力學(xué)、反應(yīng)速度、檢測敏感性、穩(wěn)定性以及自動化程度方面都有較大的優(yōu)越性，因此不少學(xué)者看好液態(tài)芯片的應(yīng)用前景。九生物傳感器生物傳感器是將新興的傳感器技術(shù)和分子診斷技術(shù)相結(jié)合而成的一種新技術(shù),是現(xiàn)代臨床檢驗診斷發(fā)展的一個新方向

18、。由于生物傳感器檢測準確、操作簡便等特點,近年來已經(jīng)在許多領(lǐng)域取得了很大的進展,在生物分子相互作用、藥物篩選、臨床診斷、食物檢測等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，其中臨床中用于病原體檢測的以DNA生物傳感器最為常見。盡管生物傳感器作為一種新的傳感元件近年來得到了很大的發(fā)展,許多光化學(xué)、電化學(xué)以及壓電晶體都相繼在生物傳感器中得到應(yīng)用。與常規(guī)的核酸和蛋白質(zhì)檢測相比,具有檢測準確、操作簡單等特點,但由于它存在靈敏度不夠、容易受雜質(zhì)干擾等缺點,隨著研究的進一步深化和技術(shù)方法的改進,這些問題將會得到解決。十 . 蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)是隨著蛋白質(zhì)組學(xué)興起的一種新技術(shù)，其中表面增強激光解吸電離飛行時間

19、質(zhì)譜蛋白芯片技術(shù)（SELDI-TOF-MS ，下稱 SELDI-TOF-MS） 是由 T. William Hutchens 和Tai-Tung Yip 等科學(xué)家在上世紀90年代早期所創(chuàng)立的一種蛋白指紋圖譜分析技術(shù)，并獲得了2002 年諾貝爾化學(xué)獎，為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、屬性、功能提供了高效而可靠的技術(shù)平臺。其原理是利用各種方法（共價鍵、電荷等）將蛋白“富集”到芯片表面，在激光的轟擊下，蛋白解吸附并電離成帶電粒子，并在電場作用下飛行，其飛行單位距離的時間取決于其所帶電荷數(shù)量和其分子量之比（質(zhì)荷比）， 從而達到分離和分析蛋白質(zhì)的目的。該技術(shù)是目前最有前途的比較蛋白質(zhì)組分析方法，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一個利器，具有獨特的優(yōu)勢和能力：可直接用粗生物樣品（血清、尿、體液）進行分析、可同時快速發(fā)現(xiàn)多個生物標記物、具有高通量的驗證能力、能發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)（靈敏度高達fmol/ml ） ，與“雙相電泳加飛行質(zhì)譜”相比，除了有相似功能外，并可增加測定疏水蛋白質(zhì)，可在同一系統(tǒng)中集發(fā)現(xiàn)和檢測為一體，SELDI 在微生物檢驗方面將發(fā)揮重要的作用。十一 . 適體技術(shù)1990 年 ,Tuerk 和 Gold 1分別獨立研制了一種新型的體外篩選技術(shù),即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù) （Systematic ev