1、第六章 食品中微生物快速檢驗技術 第六章 食品中微生物快速檢驗技術學習目標學習目標 第六章 食品中微生物快速檢驗技術概概 述述1 1、食品中微生物檢測的優點和發展趨勢、食品中微生物檢測的優點和發展趨勢 檢測食源細菌的傳統方法通常依賴于其在培養基里的生長檢測食源細菌的傳統方法通常依賴于其在培養基里的生長, ,即進行目標菌的分離和生化鑒定即進行目標菌的分離和生化鑒定, ,有時進行血清學診斷繁瑣、有時進行血清學診斷繁瑣、耗時。耗時。 隨著分子生物學和電子技術的飛速發展隨著分子生物學和電子技術的飛速發展, ,快速、準確、特異快速、準確、特異檢微生物的新技術、新方法不斷涌現檢微生物的新技術、新方法不斷涌

2、現, ,微生物檢驗技術由培養微生物檢驗技術由培養水平向分子水平邁進水平向分子水平邁進, ,并向儀器化、動化、標準化方向發展并向儀器化、動化、標準化方向發展, ,可可大大提高食品微生物檢驗工作的高效性、準確性和可靠性大大提高食品微生物檢驗工作的高效性、準確性和可靠性。 第六章 食品中微生物快速檢驗技術概概 述述2 2、食品中微生物檢測的局限性、食品中微生物檢測的局限性 大部分快速方法適用于檢測特定微生物，用于快速篩選大大部分快速方法適用于檢測特定微生物，用于快速篩選大量食品中所存在的特殊病原體。量食品中所存在的特殊病原體。 然而，快速檢方法抗干擾能力弱，所得結果必須用標準參然而，快速檢方法抗干擾

3、能力弱，所得結果必須用標準參考方法予以證實。考方法予以證實。 因此因此, ,隨著某些快速方法更加頻繁地被使用隨著某些快速方法更加頻繁地被使用, ,其優點和局限其優點和局限性同時變得更加明顯，使用在選擇和徹底評估這些快速檢測方性同時變得更加明顯，使用在選擇和徹底評估這些快速檢測方法時，必須綜合考慮各方面因素，在工作效率和可靠性上找到法時，必須綜合考慮各方面因素，在工作效率和可靠性上找到一個平衡點。一個平衡點。 第五章 食品中微生物標準檢驗與分析技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術一、什么是一、什么是3M測試片？測試片？ 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M

4、3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術二、二、3M測試片的優點測試片的優點 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術1. 工作效率的極大提高工作效率的極大提高 根據大量數據統計，使用根據大量數據統計，使用 3M Petrifilm， 可以提高實驗室工作效可以提高實驗室工作效率率 118% 以上。勞動資源的最佳使用帶來生產能力的提高，最終的以上。勞動資源的最佳使用帶來生產能力的提高，最終的效果就是效益的增加。效果就是效益的增加。 2. 標準化的檢測方法標準化的檢測方法 品質穩定的快速測試片克服了傳統的測試方法存在的由于使用不品質穩定的快速測試片

5、克服了傳統的測試方法存在的由于使用不同批次的培養基，不同的配制條件，不同配制人員而導致的差異性。同批次的培養基，不同的配制條件，不同配制人員而導致的差異性。 3. 國際化的認證方法國際化的認證方法 3M 快速測試的方法得到包括快速測試的方法得到包括 AOAC，AFNOR 在內的國際權威機構在內的國際權威機構的認證，在全球許多國家也已獲得官方機構的正式批準，從而可以確的認證，在全球許多國家也已獲得官方機構的正式批準，從而可以確保檢測結果的可靠性和在世界各地的廣泛認可。保檢測結果的可靠性和在世界各地的廣泛認可。二、二、3M測試片的優點測試片的優點 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M

6、3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術4. 快速得到檢測結果快速得到檢測結果 對比傳統的測試方法，對比傳統的測試方法， 3M快速測試片縮短檢測時間，使快速測試片縮短檢測時間，使您在更短的時間內獲得樣品的測試結果，能更加迅速地采取有您在更短的時間內獲得樣品的測試結果，能更加迅速地采取有效的措施解決發現的問題。效的措施解決發現的問題。 5. 方便進行方便進行HACCP 認證認證 由于檢測速度快，檢測項目全，準確性高。由于檢測速度快，檢測項目全，準確性高。3M為食品生為食品生產工藝過程中關鍵控制點的監控提供了較為完整的系列產品，產工藝過程中關鍵控制點的監控提供了較為完整的系列產品，可以對包括生產線

7、，生產設備和環境在內的各個環節進行全面可以對包括生產線，生產設備和環境在內的各個環節進行全面的測試。的測試。 三、三、3M測試片的操作過程（腸桿菌科為例）測試片的操作過程（腸桿菌科為例） 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術三、三、3M測試片的操作過程（腸桿菌科為例）測試片的操作過程（腸桿菌科為例） 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術四、四、3M測試片的結果判讀圖例測試片的結果判讀圖例 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術四、四、3

8、M測試片的結果判讀圖例測試片的結果判讀圖例 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術四、四、3M測試片的結果判讀圖例測試片的結果判讀圖例 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術四、四、3M測試片的結果判讀圖例測試片的結果判讀圖例 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術四、四、3M測試片的結果判讀圖例測試片的結果判讀圖例 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術四、四、3M測試片的結果判讀圖例測

9、試片的結果判讀圖例 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術四、四、3M測試片的結果判讀圖例測試片的結果判讀圖例 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術四、四、3M測試片的結果判讀圖例測試片的結果判讀圖例 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術四、四、3M測試片的結果判讀圖例測試片的結果判讀圖例 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第一節第一節 3M3M測試片快速分析技術測試片快速分析技術 第五章 食品中微生物標準檢驗與分析技術第二節第二節 Mi

10、ni-VIDAS Mini-VIDAS快速分析測試技術快速分析測試技術一、一、 Mini-VIDAS快速分析技術簡介快速分析技術簡介 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第二節第二節 Mini-VIDAS Mini-VIDAS快速分析測試技術快速分析測試技術二、二、 Mini-VIDAS快速分析技術原理快速分析技術原理 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第二節第二節 Mini-VIDAS Mini-VIDAS快速分析測試技術快速分析測試技術1、在固相包被抗體，捕獲目標菌。2、二抗酶結合物結合目標菌，催 化底物產生熒光。1、在固相包被抗體，捕獲目標菌酶結合物。2、目標菌抑制抗體和酶結合物結合，抑 制催

11、化底物產生熒光。三、三、 Mini-VIDAS快速分析技術優勢快速分析技術優勢 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第二節第二節 Mini-VIDAS Mini-VIDAS快速分析測試技術快速分析測試技術三、三、 Mini-VIDAS快速分析技術優勢快速分析技術優勢 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第二節第二節 Mini-VIDAS Mini-VIDAS快速分析測試技術快速分析測試技術 第五章 食品中微生物標準檢驗與分析技術第三節第三節 利用電導率快速分析測試技術利用電導率快速分析測試技術一、一、 電導率快速檢測微生物技術原理電導率快速檢測微生物技術原理 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第三節第三

12、節 利用電導率快速分析測試技術利用電導率快速分析測試技術 微生物在生長過程中利用低電導率的大分子物質微生物在生長過程中利用低電導率的大分子物質(如蛋白如蛋白質，多肽及碳水化合物等質，多肽及碳水化合物等)進行新陳代謝，生成低分子帶電荷進行新陳代謝，生成低分子帶電荷的分解物，使電導率發生變化。的分解物，使電導率發生變化。 電信號經放大后顯示并記錄，檢測系統每電信號經放大后顯示并記錄，檢測系統每10分鐘檢測一分鐘檢測一次電導率的變化，由計算機實時次電導率的變化，由計算機實時監控并自動給出結果。監控并自動給出結果。 因此只要先用標準方法對比因此只要先用標準方法對比做出標準曲線，就可以達到快速做出標準曲

13、線，就可以達到快速定量檢測菌數的目的。定量檢測菌數的目的。 一、一、 電導率快速檢測微生物技術原理電導率快速檢測微生物技術原理 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第三節第三節 利用電導率快速分析測試技術利用電導率快速分析測試技術 樣品中微生物數量越多，越快進入對數生長期。培養基電導率樣品中微生物數量越多，越快進入對數生長期。培養基電導率發生躍遷的時間越短。發生躍遷的時間越短。二、二、 電導率快速檢測微生物技術特點電導率快速檢測微生物技術特點 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第三節第三節 利用電導率快速分析測試技術利用電導率快速分析測試技術 1. 采用測量培養基電導采用測量培養基電導(M值值)和電

14、極電導和電極電導(E值值)結合的結合的方法，測量相對電導率變化，使靈敏度大大提高，方法，測量相對電導率變化，使靈敏度大大提高，E值測值測量法尤其適用于一些高鹽分量法尤其適用于一些高鹽分(高電導率高電導率)的選擇性增菌培養的選擇性增菌培養基，使電導率法用于致病菌快速初篩成為可能。基，使電導率法用于致病菌快速初篩成為可能。 2. 對難以測量電導變化的微對難以測量電導變化的微生物，采用測間接電導率的方法生物，采用測間接電導率的方法，通過測量，通過測量KOH吸收微生物代謝吸收微生物代謝產生產生CO2后電導率的變化反映微后電導率的變化反映微生物的生長情況。生物的生長情況。三、三、 電導率快速檢測微生物技

15、術優勢電導率快速檢測微生物技術優勢 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第三節第三節 利用電導率快速分析測試技術利用電導率快速分析測試技術 1. 靈敏度高。最低可檢測出靈敏度高。最低可檢測出0.2-1個個/mL(克克)樣品。樣品。 2. 可檢測樣品種類廣，檢測的微生物項目多。可檢測樣品種類廣，檢測的微生物項目多。 3. 檢測速度快。大部分項目檢測速度快。大部分項目24小時內出結果，樣品含菌小時內出結果，樣品含菌量越高，出結果越快，只需數小時即給出結果。量越高，出結果越快，只需數小時即給出結果。 4. 檢測步驟簡單。廠家提供特殊配方的培養基，只需將檢測步驟簡單。廠家提供特殊配方的培養基，只需將樣品加

16、入培養基中，放入儀器，然后啟動程序即可自動出樣品加入培養基中，放入儀器，然后啟動程序即可自動出結果。對于液體樣品無需復雜前處理，固體樣品只需進行結果。對于液體樣品無需復雜前處理，固體樣品只需進行必要的均質和稀釋即可。必要的均質和稀釋即可。 一、一、 膜過濾熒光染色法原理膜過濾熒光染色法原理 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第四節第四節 膜過濾熒光染色法膜過濾熒光染色法二、二、 膜過濾熒光染色法步驟膜過濾熒光染色法步驟 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第四節第四節 膜過濾熒光染色法膜過濾熒光染色法三、三、 膜過濾熒光染色法儀器膜過濾熒光染色法儀器 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第四節第四節 膜

17、過濾熒光染色法膜過濾熒光染色法一、利用葡萄糖醛酸酶定量檢測一、利用葡萄糖醛酸酶定量檢測E. Coli 大腸桿菌重要衛生學指標，是環境監測、食品安全、衛生防大腸桿菌重要衛生學指標，是環境監測、食品安全、衛生防疫監測中必檢的一個項目。傳統的大腸菌群檢測法試驗過程繁疫監測中必檢的一個項目。傳統的大腸菌群檢測法試驗過程繁雜、檢測工作量大、費用較高，而且不適合進行大腸桿菌定量雜、檢測工作量大、費用較高，而且不適合進行大腸桿菌定量檢測。檢測。 絕大多數大腸桿菌具有葡萄糖醛酸絕大多數大腸桿菌具有葡萄糖醛酸酶，能分解葡萄醛酸苷。使無色原性酶，能分解葡萄醛酸苷。使無色原性-底物（底物（4甲基傘花內脂甲基傘花內脂

18、-D葡萄糖苷酸）葡萄糖苷酸）生成甲基傘形酮葡萄糖苷酸，在生成甲基傘形酮葡萄糖苷酸，在365nm紫外燈下觀察出現藍亮色熒光，可以實紫外燈下觀察出現藍亮色熒光，可以實現定量檢測。現定量檢測。 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第五節第五節 利用酶促反應定量檢測微生物利用酶促反應定量檢測微生物二、二、 ATP熒光法檢測總菌落數熒光法檢測總菌落數 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第五節第五節 利用酶促反應定量檢測微生物利用酶促反應定量檢測微生物 螢火蟲會發光是由于它能合成螢火蟲會發光是由于它能合成將化學物質的化學能轉變為光能的將化學物質的化學能轉變為光能的生物催化劑生物催化劑熒光素酶、蟲熒光素熒光素酶、

19、蟲熒光素(D-luciferin)以及所有細胞生物以及所有細胞生物都產生的生物能量物質都產生的生物能量物質三磷酸腺苷（三磷酸腺苷（ATP）。）。 在有氧的條件下，蟲光素酶催化蟲熒光素和在有氧的條件下，蟲光素酶催化蟲熒光素和ATP之間發生之間發生氧化反應，形成氧化熒光素并發出熒光，其生化反應式如下：氧化反應，形成氧化熒光素并發出熒光，其生化反應式如下：二、二、 ATP熒光法檢測總菌落數熒光法檢測總菌落數 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第五節第五節 利用酶促反應定量檢測微生物利用酶促反應定量檢測微生物 上式表明，只要具備適當條件，不僅螢火蟲，即使在試管中上式表明，只要具備適當條件，不僅螢火蟲，即

20、使在試管中也能發出熒光。當反應系統中，蟲光素酶和蟲熒光素處于過量也能發出熒光。當反應系統中，蟲光素酶和蟲熒光素處于過量的情況下，熒光的強弱取決于的情況下，熒光的強弱取決于ATPATP的數量。的數量。 在食品樣品中，細菌細胞越多，在食品樣品中，細菌細胞越多，ATPATP量越高，發出的熒光也量越高，發出的熒光也就越強。就越強。 所以，在排除樣品中非細菌所以，在排除樣品中非細菌ATPATP干擾的情況下，通過熒光值干擾的情況下，通過熒光值就能確定樣品中細菌就能確定樣品中細菌ATPATP的含量，從而確定細胞數量。的含量，從而確定細胞數量。ATP+ O +Luciferin+Luciferase =2O

21、xyluciferin+AM P+ PPi+ CO2檢測原理熒光素熒光素酶腺苷一磷酸氧合熒光素熒光三、三、 MTT法檢測總菌落數法檢測總菌落數 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第五節第五節 利用酶促反應定量檢測微生物利用酶促反應定量檢測微生物 檢測原理為活體微生物線粒體中含有琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶，能使外源性MTT（噻唑藍）還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。 Formazan結晶形成的量與活菌數成正比。用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活菌細胞數量。 該方法的特點是檢測靈敏度高、快速。在腫瘤細胞殺傷藥物篩選中應用廣泛

22、，在食品衛生監測中也有應用的報道。三、三、 MTT法檢測總菌落數法檢測總菌落數 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第五節第五節 利用酶促反應定量檢測微生物利用酶促反應定量檢測微生物應用實例1：巴氏消毒奶中活菌素快速檢測 取巴斯消毒奶10mL ，至于無菌離心管中3000rpm離心5分鐘，棄去上清。加入10mL無菌生理鹽水洗滌離心管，再次3000 rpm離心5分鐘，棄去上清取出奶液基質。加入1mL生理鹽水重懸底部的微生物，取0.2mL到96孔酶標板中，同時加入標準菌液做標準曲線，統一加入底物反應30分鐘，讀數。一、一、 血清學方法血清學方法 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第六節第六節 利用免疫反應

23、快速檢測微生物利用免疫反應快速檢測微生物圖圖示示幾幾種種操操作作類類型型的的原原理理一、一、 血清學方法血清學方法(基本原理回顧第基本原理回顧第3章章) 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第六節第六節 利用免疫反應快速檢測微生物利用免疫反應快速檢測微生物實例實例1：化膿性鏈球菌的免疫聚集快速檢測：化膿性鏈球菌的免疫聚集快速檢測菌體凝集試驗菌體凝集試驗免疫散射比濁法免疫散射比濁法二、二、 酶聯免疫吸附檢測方法酶聯免疫吸附檢測方法 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第六節第六節 利用免疫反應快速檢測微生物利用免疫反應快速檢測微生物 ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高

24、效催化作用相結合的一種敏感性很高的實驗技術。 分點理解分點理解: 1. 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記； 2. 結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性； 3. 酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留其酶的活性。 在ELISA測定方法中有3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標記的抗原或抗體（標記物） 酶作用的底物（顯色劑）固相載體抗體抗原酶抗體酶標記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗體，則結合為抗體-抗原-酶標記抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。實例：雙抗體夾心實例：雙抗體夾心ELISA法檢測霍

25、亂弧菌法檢測霍亂弧菌 以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細血管以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過抗作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過抗原抗體結合，并利用膠體金呈現顏色（紅色）反應，檢測原抗體結合，并利用膠體金呈現顏色（紅色）反應，檢測抗原抗原/ /抗體。抗體。最常用的是雙抗夾心法檢測抗原最常用的是雙抗夾心法檢測抗原三、三、 免疫膠體金層析快速檢測方法免疫膠體金層析快速檢測方法 第六章 食品中微生物快速檢驗技術第六節第六節 利用免疫反應快速檢測微生物利用免疫反應快速檢測微生物膠體金原理示意圖（檢測單增李斯特菌為例）膠體金原理示意圖（檢測單增李斯特菌為例）檢測線檢測線質檢線質檢線吸收墊吸收墊樣品墊樣品墊硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜連接墊連接墊（膠體金墊）（膠體金墊）背襯背襯（底板）（底板）p病毒性疾病：病毒性疾病：傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫、傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫、犬細小病毒、豬瘟等。犬細小病毒、豬瘟等。p寄生蟲疾病：寄生蟲疾病：血吸蟲病、旋毛蟲病、囊蟲病、恙血吸蟲病、旋毛蟲病、囊蟲病、恙蟲病。蟲