1、精選優質文檔-傾情為你奉上植物細胞工程一、專業符號生長素類：IAA 吲哚乙酸 IBA 吲哚丁酸 NAA萘乙酸 2,4-D 2,4-二氯苯氧乙酸細胞分裂素類：KT 激動素 6-BA（6-BAP）6-芐基氨基嘌呤 ZT玉米素GA3赤霉酸 ABA脫落酸 醋酸酯熒光素（FDA）染色法DMSO 二甲基亞砜 二、名詞解釋1、微室培養法：人工制造一個小室，將單細胞培養在小室中的少量培養基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。 2、看護培養法：用一塊愈傷組織或植物離體組織看護單細胞使其生長增殖的一種單細胞培養方法。3、綠島法：在植株上使葉面細胞產生突變并創造選擇壓力，令抗性突變細胞正常生長形成綠色斑點，謂之“綠島

2、”，其為突變細胞，分散和培養后可得完整植株4、植物原生質體：除去纖維素外壁且具有生活力的裸體植物細胞5、體細胞胚胎發生途徑：指由培養細胞誘導分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結構，進而長成完整植株。6、愈傷組織：脫分化后的細胞，經過細胞分裂，產生無組織結構、無明顯極性的、松散的細胞團。 7、細胞分化：是指導致細胞形成不同結構，引起功能改變或潛在發育方式改變的過程8、細胞懸浮培養(cell suspension culture)：將單個游離細胞或小細胞團懸浮在液體培養基中進行培養增殖的技術。9、細胞平板培養：將制備好的單細胞懸浮液，按照一定的細胞密度，與融化的瓊脂培養基均勻混合，并平鋪一薄層在培養皿

3、底上的培養方法10、器官發生途徑：離體培養的組織、細胞在誘導條件下經分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過程。有兩種發生方式：（1）直接發生：（具有初生分生能力的）外植體直接分化成器官的過程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官發生）；（2）間接發生：外植體（已分化的成熟組織）經脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程。11、Ti質粒：農桿菌染色體外的遺傳物質，為雙鏈共價閉合的環狀DNA分子，有三個功能區：T-DNA區，病毒區(Vir區)和冠癭堿代謝基因的編碼區。在T-DNA區和Vir區基因的協同作用下，農桿菌完成侵染植物細胞和轉移T-DNA的過程。12、植物細胞脫分化：離體培養條件下，一個已

4、分化的細胞回復到原始無分化狀態或分生組織細胞狀態或胚性細胞的狀態的過程。三、填空題：1、植物細胞大規模培養方式主要有：分批培養法，連續培養法，半連續培養法和固定化培養法2、誘導植物細胞融合的因素主要有：PEG誘導；NaNO3誘導；高鈣和高PH誘導；高鈣和高PH及PEG結合誘導3、一般認為形成的器官的類型受培養基中兩類激素的相對濃度的控制，較高濃度的 生長素 有利于根的形成而抑制芽的形成，相反，較高濃度的 細胞分裂素 則促進芽的形成而抑制根的形成。4、植物原生質體發育及植株再生途徑主要有：細胞壁再生；細胞分裂和生長；愈傷組織形成與分化；植株再生5、制備植物原生質體過程中，酶解去細胞壁時，為保證原

5、生質體的穩定性，常加入滲透穩定劑(糖溶液系統：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等；鹽溶液系統：包括KCl、MgS04和KH2PO4等);細胞質膜穩定劑 (葡萄糖硫酸鉀、MES、CaCl2H2O、KH2PO4等).6、植物原生質體制備需要的酶：纖維素酶和果膠酶7、常用的生長素有_ 吲哚乙酸_、_萘乙酸_、_2,4-D_ 、_吲哚丁酸_等，常用的細胞分裂素_激動素_ 、_6-芐基氨基嘌呤_、_玉米素_8、由愈傷組織再生植株有兩條途徑：一步成苗（原生質體形成的愈傷組織直接轉移到分化培養基上可一步成苗）和兩步法成苗（即首先將愈傷組織培養于含低濃度生長素培養基上，讓其增殖和調整狀態，再其轉移到分化培養基

6、上分化成苗）四、問答題1、植物細胞實驗室培養方法有哪幾種？液體淺層培養法：將懸浮在培養液中的細胞過濾得到游離單細胞和小細胞團，培養在淺層液體培養基中。用途：主要用來增殖細胞。特點：有利于有毒物質的擴散；有利于氣體交換；不利于定點觀察；單細胞生長、分裂后，難以得到單細胞系；固體平板培養法：將制備好的單細胞懸浮液，按照一定的細胞密度，與融化的瓊脂培養基均勻混合，并平鋪一薄層在培養皿底上的培養方法。用途：是為了分離單細胞無性系，研究其生理、生化的遺傳上的差異而設計的一種單細胞培養技術。廣泛應用于細胞、原生質體及融合產物的培養。特點：可以定點觀察；分離單細胞系比液體淺層培養容易；培養細胞氣體交換不暢；

7、看護培養：指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長和增殖的方法。用途：誘導形成單細胞系。特點：效果好，易于成功；簡便易行；不能在顯微鏡下直接觀察細胞的生長過程；微室培養：人工制造一個小室，將單細胞培養在小室中的少量培養基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。用途：主要用來觀察細胞生長、分裂、形成細胞團的過程。特點：能在顯微鏡下追蹤單細胞分裂增殖形成細胞團的全過程；培養基少，營養和水分難以保持，pH值變動幅度大，培養細胞僅能短期分裂。其它單細胞培養技術：飼養層培養基技術：將飼養細胞先用射線輻射處理，然后將飼養細胞和培養細胞混合植板，經過照射的細胞對于培養細胞起到一個飼養作用；雙層濾紙植板

8、培養方法。2、植物細胞培養的植株再生步驟有哪些？A.器官發生：離體培養的組織、細胞在誘導條件下經分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過程。（1）直接發生：（具有初生分生能力的）外植體直接分化成器官的過程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官發生）（2）間接發生：外植體（已分化的成熟組織）經脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程。B.胚狀體方式(somatic embryo)：指由培養細胞誘導分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結構，進而長成完整植株。由外植體經胚狀體形成完整植株可分三個不同發育階段：1)外植體細胞脫分化：外植體發生細胞分裂，或進而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。2)胚狀體形

9、成：在植物有性生殖中，精于和卵子結合形成合子，合子進一步發育成胚。但在組織培養條件下胚狀體的發育過程是：細胞經脫分化后，發生持續細胞分裂增殖，并依次經過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，進而成為成熟的有機體。我們把由愈傷組織的類似薄壁組織細胞不經有性過程而直接產生類似胚的這一結構，稱為胚狀體。3)胚狀體再發育成完整植株：在外觀上，這種方式和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀。3、植物細胞融合過程如何？融合特點是什么？融合過程：凝聚作用階段，其間兩個或兩個以上的原生質體的質膜彼此靠近；在很小的局部區域質膜緊密粘連，彼此融合，在兩個原生質體之間細胞質呈現連續狀態，或是出現橋；由于細胞質橋

10、的擴展，融合完成，形成球形的異核體或同核體。特點：無物種限制；雜種含雙親性質4、PEG融合與電融合的基本原理是什么？各有何特點？PEG融合:原理：PEG是一種帶負電性的高分子化合物，在原生質體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質體凝聚。在洗脫過程中，PEG將被洗掉，導致質膜表面電荷重排。粘連的質膜大面積緊密相連，電荷的重排隊導致一個原生質體的負性電荷部位與另一原生質體的正性電荷部位相連而導致融合。優點：是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點：是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。電融合：原理：交流電場使原生質體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠；施

11、加直流電場后，形成串珠的原生質體在質膜接觸處發生穿孔，開始遺傳物質的交流優點：是不存在對細胞的毒害問題；是融合效率高；是融合技術操作簡便。 基因工程一專業符號Tetr 四環素抗性 R/M體系 限制與修飾現象Ampr 氨芐青霉素抗性 pBR322 質粒載體M13 單鏈DNA噬菌體載體 cosmid 科斯質粒IPTG 異丙基-D硫代半乳糖苷 DNA ligase DNA連接酶EcoRI 限制性酶切位點 host 宿主Plasmid 質粒 Ori 復制起始位點vector 載體 cDNA 反轉錄互補DNAsouthern blot DNA印跡轉移技術 MCS 多克隆位點二名詞解釋1.生物工程bioe

12、ngineering ：利用生物有機體（包括微生物和動、植物）或其組成部分（包括器官、組織、細胞、細胞器）和組織成分（包括DNA、RNA、蛋白質、酶、多糖、抗體等），形成新的技術手段來發展新產品和新工藝的一種技術體系。 2.基因工程 ：是指按照人們的意愿，在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其他載體分子，構成遺傳物質的新組合，并使之轉入到原先沒有這類分子的宿主細胞內，形成能持續穩定繁殖的新物種。其目的是為人類提供有用產品及服務。 3.同聚物加尾法：利用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)轉移核苷酸的特殊功能，將同種核苷酸（dNTP)加到DNA分子單鏈延伸末端的3-OH上。如果在目的基因兩側加polydA

13、，則在載體兩側加polydT。長度一般10-40個殘基。 4.DNA接頭：是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 5.R/M體系 ：大多數的細菌對于噬菌體的感染都存在一些功能性障礙，即所謂的寄主控制的限制(restriction)和修飾(modification)現象，簡稱R/M體系。（作用：一是保護自身的DNA不受限制，二是破壞外源DNA使之迅速降解。） 6.同尾酶：與同裂酶對應的一類限制酶，它們雖來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但都產生出相同的粘性末端，稱為同尾酶。 7.啟動子：是基因的一個組成部分，控制基因表達（轉錄）的起始時間和表達程

14、度，是位于結構基因5端上游的一段DNA序列，能夠指導全酶同模板正確結合，活化RNA聚合酶，啟動基因轉錄。 8.多克隆位點：指多個限制性內切酶的單一切點。由許多限制酶切點組成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。 9.同裂酶 ：識別順序與切割方式均相同者，為之同裂酶。 10.銜接物連接法（linker）：將銜接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后通過T4DNA連接酶的作用是兩者連接起來，接著用適當的限制酶消化具銜接物的DNA分子和載體分子，由此使兩者都產生出彼此互補的粘性末端。 11插入滅活效應：外源性DNA克隆到插入型的載體分子上會使噬菌體的

15、某些生物功能喪失，即所謂插入滅活效應。 12.蛋白質工程:是指通過蛋白質化學、晶體學和動力學的研究，獲取關于蛋白質物理、化學等各方面的信息，在此基礎上，對編碼該蛋白質的基因進行有目的的改造，并通過基因工程等手段將其進行表達和分離純化，最終得到比天然蛋白質更好的產物。13.免疫分析法: 利用抗原-抗體反應來檢測含目的基因的重組轉化體或嗜斑的技術稱為免疫分析法。條件：只要目的基因在宿主中表達相應蛋白質，并能獲得相應抗體，即可用本技術檢測相應DNA。14.感受態細胞:能從其周圍攝入DNA的細胞稱為感受態細胞?；蚬こ讨?，宿主細胞需經人工處理成能吸收重組DNA分子的敏感狀態，才能用于轉化，這種敏感細胞

16、稱為人工感受態細胞。15.原位雜交技術:根據核酸雜交原理，利用基因探針檢出培養板上重組 轉化體菌落位置的技術稱之為原位雜交技術。16.標記營救：SV40DNA為載體的取代克隆方式分為早期基因區域取代及晚期基因區域取代兩種類型。晚期基因區域取代方式是以外源DNA片段取代晚期基因區域，構成的重組DNA在宿主中可以復制，但不能產生重組病毒顆粒，因而采用早期基因缺失的SV40病毒突變種作為輔助病毒與晚期取代重組DNA或和感染宿主，則晚期區域取代重組DNA可獲得標記營救，輔助病毒產生的晚期基因產物與重組病毒的早期基因產物一起可形成完整病毒顆粒。17.銜接物：是指用化學方法合成的一段由10-12個核苷酸組

17、成，具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸段片斷。18.基因文庫：所謂基因組文庫是將基因組DNA通過限制性內切酶部分酶解后所產生的基因組DNA片段隨機地同相應的載體重組、克隆，所產生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。19.轉化Transformation: 自然的轉化是指將攜帶某種遺傳信息的DNA分子引入宿主細胞，通過同源重組作用。獲得具有新遺傳性狀的生物細胞的過程?；蚬こ滩僮髦械霓D化是泛指將重組DNA轉入宿主中的方法。20.回文結構：位點上核苷酸順序通常呈雙重旋轉對稱結構，即呈回文結構。21.安慰誘導物:在M13體系中，已將Lac阻遏基因的Iq突變引入宿祖細胞。該Iq突變

18、基因可產生出10余倍超量的阻遏物。這些阻遏物的存在可以抑制Lac操縱子的表達。IPTG是一種乳糖類似物，再無乳糖的條件下，他可以誘導細胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG被稱為半乳糖苷酶的安慰誘導物。22.DNA接頭法（adaptor）：是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。23.DNA-蛋白質篩選法: DNA-蛋白質篩選法是用來專門檢測同DNA特異結合的蛋白質因子的中的外源DNA編碼一種能專門同某一特定DNA序列結合的DNA結合蛋白質.三、填空題

19、1.基因工程載體的必備條件:A.具有有效運載能力;B.攜帶外源性目的基因前后在宿主內功能自主復制;C.在宿主內能控制外源基因表達活動;D.鑒定方便，裝卸手續簡單;E.能攜帶大小不同的外源性目的基因、載體分子量要小,載力要大;F.容易控制、安全可靠、穩定性好.2.常用的將重組DNA轉入宿主細胞的方法CaCl2處理后的細菌轉化與轉染；高壓電穿孔法；聚乙二醇介導的原生質體轉化；磷酸鈣或DEAE-葡聚糖介導的轉染；原生質體融合；脂質體法；細胞核的顯微注射法；激光打孔技術。3.基因工程基本步驟獲得目的基因；在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能自我復制并具有選擇性標記的載體分子上，形成重組DNA

20、分子；將重組DNA分子轉移到適當的宿主細胞中，并與之一起增殖；從大量細胞繁殖群體中，篩選出獲得重組DNA分子的宿主細胞克隆；從這些篩選出來的宿主細胞克隆中，提取出已經得到擴增的目的基因，供進一步分析研究用；將目的基因克隆到表達載體上，導入宿主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，產生出人類所需要的物質。4.E.coli表達系統中常用的強啟動子Lac Trp PL PR5.目的基因制備方法基因分離的物理方法；鳥槍法；cDNA文庫的建立與基因分離；基因組文庫法；基因的化學合成；聚合酶鏈式反應技術（PCR）。6.外源基因在宿主細胞中高效表達的關鍵因素有效的轉錄起始；mRNA的穩定性；有效地翻譯啟始

21、；遺傳密碼應用的偏倚性； mRNA的加工； mRNA序列上終止密碼的選擇；表達質?？截悢导胺€定性；外源基因的穩定性。7.PCR主要步驟：高溫變性；低溫退火；適溫延伸。8.常用的克隆載體Col E1質粒載體；pSC101質粒載體；pBR322質粒載體； pUC質粒載體；噬菌體DNA克隆載體；科斯質粒載體；單鏈DNA噬菌體M13載體。9.DNA片段的連接方法平頭雙鏈DNA分子的連接（T4DNA連接酶）；粘性末端DNA片段的連接（DNA連接酶）；平末端DNA片段的連接（同聚物加尾法，銜接物連接法，DNA接頭連接法）。10.真核病毒載體的優點:有很高的拷貝數；強大的啟動子，可保證外源基因的高效表達；可

22、保證糖基化。11.原核表達系統中，主要表達方式非融合蛋白的胞內表達；融合蛋白的胞內表達；分泌表達。四、問答題1.基因獲得的方法有哪些？各有哪些特點？基因分離的物理方法：根據DNA分子的兩條鏈存在著GC，A=T堿基配對。如DNA分子中某段的GC堿基對含量高，則其熱穩定性就高，其溶解溫度（Tm）就高。通過控制溶解溫度使富A=T區解鏈變性，而富GC區仍維持雙鏈。當利用單鏈核酸酶S，酶去除解開的單鏈部分，得到富GC區的DNA片段 。鳥槍法(Shot gun) 又稱霰彈法:A.優點：操作簡單，命中率較高;B.缺點：盲目性大，陽性片段不一定正好是基因，樣本多，可能會漏。cDNA文庫的建立與基因的分離:是以

23、mRNA為模版，用反轉錄酶合成互補DNA的方法。cDNA文庫最關鍵的特征是它只包括在特定的組織或細胞類型中已經被轉錄成mRNA的那些基因序列?；蚪M文庫法:從基因組文庫所分離獲得的基因序列包含有內含子，因此不能直接在原核細胞中表達，但更適合作為如轉基因動物等的真核表達系統?；虻幕瘜W合成:優點:A.可以合成細菌偏愛的密碼子;B.可以定向改變個別氨基酸;C.可以在兩端加上需要的限制酶切點;D.可以通過自動化儀器合成.缺點：必須對基因的結構序列清楚。聚合酶鏈反應技術（PCR）:優點：A.操作簡單;B.通用性好;C.成功率高.2.cDNA文庫的建立有哪些步驟? A.分離表達目的基因的組織或細胞;B.

24、從組織和細胞中制備總RNA和mRNA;C.第一條cDNA鏈的合成;D.第二條cDNA鏈的合成;E.cDNA上接頭的加入;F.雙鏈cDNA與載體的連接;G.從眾多的重組體中篩選出特定的基因.3.限制酶命名原則是什么?凡能識別并切割雙螺旋DNA分子內特定核苷酸順序的酶統稱為限制酶。命名原則：屬種株分離序號例如：EcoR 屬：Escherichia 種：coli 株：R 分離序號：第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二，第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發現的先后次序。*4.外源基因在宿主細胞高效表達的關鍵問題及其解決方案A.有效的轉錄起始與基因的高效表達：選

25、擇強的可調控的啟動子;B.mRNA的穩定性與基因高效表達：利用RNase缺失的受體菌;mRNA的5端與3端的正確加工，提高mRNA的穩定性;C.有效地翻譯啟始與基因的高效表達: 首選AUG為起始密碼子；正確的SD序列； SD序列與起始密碼子之間的距離以93為宜；除SD序列外，處于起始密碼5端的核苷酸應為A和U；如果在起始密碼AUG后的序列是GCAU或AAAA，能使翻譯效率提高；在翻譯起始區周圍的序列應不形成明顯的二級結構;D.遺傳密碼應用的偏倚性與基因高效表達:真核細胞與原核細胞對遺傳密碼的偏倚性不同，在不同表達系統中，使用偏倚性密碼，尤其對于基因編碼序列的5端使用偏倚性密碼，能有效提高表達效

26、率;E.mRNA的加工與基因高效表達:絕大多數較高等的真核基因含有內含子，這些內含子在mRNA的加工過程中，在細胞核中被加工去除而產生成熟的mRNA。但許多哺乳動物類細胞中外源基因的表達需要內含子存在，如果在轉基因動物中表達外源基因時，最好用基因組基因而非cDNA;F.mRNA序列上終止密碼的選擇: 首選UAA; 用一串連的終止密碼，而不是只是一個終止密碼，以保證翻譯有效終止;G.表達質?？截悢导胺€定性與基因高效表達:一般來講：質?？截悢刀?，基因表達水平高；表達質?？截悢导胺€定性與基因高效表達;H.外源蛋白的穩定性與基因高效表達: 通過組建融合基因，產生融合蛋白；產生可分泌的蛋白質；以包含體的

27、形式表達；選擇合適的宿主表達系統。5.假如用大腸桿菌生產人的-珠蛋白，必須經過幾個基本步驟(參考填空題3題)獲得目的基因序列（過程，方法）設計引物（PCR擴增，文庫法，cDNA）選擇載體宿主篩選發酵培養分離純化。6.平末端DNA片段的連接有哪些方法，各有什么特色？A. 同聚物加尾法: 優點：是連接任何兩段DNA分子的普遍性方法；缺點：插入的片段難以回收。無法控制外源基因插入方向；B. 銜接物連接法:優點：克隆后還可回收原插入片斷；缺點：如果待克隆的DNA片段或基因的內部也含有與所加的銜接物相同的限制位點，這樣在酶切消化銜接物產生粘性末端的同時，也會把所克隆的基因切成不同的片段，從而對后繼的亞克

28、隆及其他操作造成麻煩。C. DNA接頭連接法：優點：一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組；缺點：各個DNA接頭分子的粘性末端之間，會通過互補堿基間的配對作用，形成如同DNA銜接物一樣的二聚體分子，失去接頭的本來意義。（克服的方法是將5末端的磷酸修飾移去，其結果為暴露出的5-OH所取代。如此一來，雖然兩個接頭分子粘性末端之間仍具有互補堿基配對的能力，但終因DNA連接酶無法在5-OH和3 OH之間形成磷酸二酯鍵而不會產生出穩定的二聚體分子。）7.蛋白

29、質工程的主要步驟有哪些？分離純化需改造的目的蛋白；了解其一級結構及高級結構，了解其結構-功能關系；獲取編碼該蛋白的基因序列；設計改造方案；對基因序列進行改造；將經過改造的基因序列重組入表達載體，進行表達；分離純化表達產物，并對其功能進行檢測。補充：1 限制酶：凡能識別并切割雙螺旋DNA分子內特定核苷酸順序的酶統稱為限制酶。2 基因工程新技術：蛋白質工程，反義藥物，RNAi技術，新生物技術疫苗。3.核酸疫苗制備：目的抗原基因的選擇和獲得（構建cDNA文庫，PCR擴增，人工合成）；選擇合適的表達載體；對在表達載體上的基因序列進行測定。4.基因文庫的構建：隨機酶切成較大的DNA片段（1030Kb，平

30、均20Kb)，對這些片段進行分離；重組入適當載體（噬菌體）；轉化進宿主菌（E.coli)，擴增，構建成基因文庫；從基因組文庫中篩選出含有目的基因組的重組子。5.PCR技術：是指在四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸為引物，以單鏈DNA為模板，經DNA聚合酶催化，合成DNA互補鏈達到基因擴增目的的過程。 PCR反應的必要條件：須知基因兩端的部分序列PCR反應中的幾個關鍵因素：Taq DNA聚合酶；引物的長度；模板。6.科斯質粒：是人工構建的，含有DNA 的粘性(cos)末端序列、質粒復制起始區及質粒一個抗藥性標記的、兼具質粒與噬菌體DNA載體雙重性質的特殊載體。酶工程一、 專業符號

31、及名詞解釋1. NADPH 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸2. DEAE 二乙氨乙基葡聚糖3. DNP 二硝基苯酚4. error prone PCR 易錯PCR5. DNA shuffling DNA改組6. IU 酶活力國際單位7. Katal 酶活力單位8. 酶工程指通過化學方法、酶學方法和DNA重組技術改善自然酶的組成、結構和性質，以提高酶的催化效率、降低成本并在大規模工業化生產中進行應用的技術9. 酶的活力單位酶在最適條件下，單位時間內，酶催化底物的減少量或產物的生成量（IU：指在特定條件下，1min內生成1mol產物的酶量）10. 酶的比活力每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數 酶的比活

32、力=酶活力單位數/毫克酶蛋白11. 固定化酶（Immobilized enzyme）通過物理和化學的方法將酶束縛在一定空間內且仍具有催化活性的酶制劑12. 固定化細胞（Immobilized cell）指被限制或定位于特定空間位置的細胞，與固定化酶一起統稱為固定化生物催化劑。13. 固定化酶的操作半衰期固定化酶活力下降為原初活力一半時所經歷的連續操作時間稱為其操作半衰期，其長短顯示出固定化酶操作穩定性的高低14. 固定化酶的偶聯效率固定化反應過程中載體結合蛋白質的能力稱為偶聯效率偶聯效率（%）=（加入的總酶蛋白量上清液殘留總蛋白量）/加入的總酶蛋白量100%偶聯效率（%）=（加入的總酶活力上清

33、液殘留總酶活力）/加入的總活力100%15. 固定化酶的活力回收率偶聯反應后，固定化酶所顯示的活力與加入偶聯液中酶的總活力的比值活力回收率（%）=固定化酶總活力/加入偶聯液總酶活力100%16. 固定化酶的相對活力已被固定化的酶的活力與同樣蛋白質量的天然酶活力的比值相對活力（%）=固定化酶總活力/（加入酶總活力上清液中未偶聯酶總活力）100%17. 酶反應器以酶（游離酶或固定化酶）作為催化劑進行酶促反應所需的設備18. 酶分子的化學修飾在分子水平上對酶進行改造，即在體外將酶的側鏈基團通過人工方法與一些化學基團，特別是具有生物相容性的大分子進行共價連接，從而改變酶的酶學性質的技術。19. 生物傳

34、感器以固定化的生物成分（如酶、蛋白質、DNA、抗體、抗原）或微生物體本身（如細胞、微生物、組織等）為敏感材料，與適當的化學換能器相結合，用于快速檢測物理、化學、生物量的新型器件20. 酶的非水相催化酶在非水相（也稱為非水介質）中也具有催化活性，可以在含有多種有機溶劑和微量水分的非水介質中發揮催化作用21. 抗體酶抗體酶又稱催化抗體（catalytic antibody），是一類具有抗體的高度特異性又具有酶的高效催化活性的蛋白質分子22. 極端微生物能在極端環境中生長的微生物叫做極端微生物。極端環境指普通微生物不能生存的環境，如高溫、低溫、低PH、高PH、高鹽、高輻射、含抗代謝物、有機溶劑、低營

35、養、重金屬及有毒有害物等環境條件二、 填空題1. 酶分子的化學修飾的具體方法包括 酶分子的主鏈修飾 、 酶分子的側鏈基團修飾 、 酶分子的化學交聯修飾、 酶分子的大分子修飾 、 酶分子的親和標記修飾 、 酶分子的基因修飾 和 與輔助因子相關的修飾 。2. 抗體酶的制備方法有 誘導法 、 引入法 、 拷貝法 和 抗體庫法 。3. 1961年國際生物化學聯合會酶學委員會根據反映類型，將酶類分為 氧化-還原酶 、 轉移酶 、 水解酶 、 裂合酶 、 異構酶 、和 連接酶 。三、 問答題1. 酶有什么特性？什么是酶工程？酶具有以下特性：1、酶是蛋白質；2、酶的催化效率非常高 ；3、酶具有高度的專一性；

36、4、酶的反應條件溫和（常溫、常壓） ；5、酶的催化活性受到調節和控制。酶工程：指通過化學方法、酶學方法和DNA重組技術改善自然酶的組成、結構和性質，以提高酶的催化效率、降低成本并在大規模工業化生產中進行應用的技術2. 常用的固定化酶的方法有哪幾種，試對各種方法進行綜合比較 ？吸附法：分為物理吸附法及離子交換劑吸附法。優點：操作簡單，可選用帶不同電荷和不同形狀的載體，固定化過程可以與純化過程同時實現，酶失活后載體仍可再生。缺點：最適吸附酶量無規律遵循，對不同載體和不同酶的吸附條件不同，吸附量與酶活力不一定呈平行關系。酶與載體之間結合力不強，酶易于脫落，導致酶活力下降并污染產物。共價結合法：酶分子

37、的活性基團與載體表面活潑基團之間經化學反應形成共價鍵的連接法常用基團：氨基、羧基、酚基及咪唑基等優點：酶與載體結合牢固，操作穩定性良好。缺點：載體需活化，固定化操作復雜，反應條件較劇烈，酶易失活并產生空間位阻效應。交聯法：采用雙功能或多功能試劑使酶分子內或分子間彼此連接成網絡結構而使酶固定化的技術。本法又分為（1）交聯酶法、（2）酶與輔助蛋白交聯法、（3）吸附交聯法、（4）載體交聯法包埋法：分為凝膠包埋法及微囊化包埋法兩類優點：制備固定化酶的操作條件溫和，不改變酶的結構，操作時保護劑及穩定劑均不影響酶的包埋率，適用于多種酶、粗酶制劑、細胞器及細胞的固定化。缺點：固定化酶只適用于小分子底物及小分

38、子產物的轉化反應，不適用于催化大分子底物或產物的反應。由于擴散阻力將導致酶動力學行為改變而降低活力3. 固定化酶的偶聯效率的測定方法有哪幾種？殘留法、水解法4. 影響固定化酶反應動力學的因素有哪幾種？構象效應、屏蔽效應（或稱位阻效應）、微環境效應（或稱分配效應）、擴散效應5. 常用的固定化酶的活力測定方法有幾種？分批測定法、連續測定法6. 與天然酶相比，固定化酶具有哪些優點？（1）穩定性較天然酶高（2）反應后，酶與底物易于分開，并可長期反復使用（3）反應液中無殘留酶，產物易于純化，產品質量高（4）可實現轉化反應連續化和自動化控制；（5）酶的利用效率高，產品成本低。（6）轉化反應基本無三廢排出，

39、因此稱之為“無公害酶”7. 與固定化酶相比，固定化細胞具有哪些優點？（1）無需進行酶的分離純化、減少起始投資；（2）細胞保持原初生命活動狀態，固定化過程酶回收率高；（3）細胞內酶較固定化酶穩定性更高；（4）細胞內輔因子可以自動再生；（5）細胞本身含多酶體系，可催化一系列反應；（6）抗污染能力強。8. 酶的抑制劑按照抑制作用方式分為哪幾類?競爭性抑制：與底物結構類似的物質能在酶的活性部位與酶結合，使酶促反應速率下降非競爭性抑制：抑制劑可在酶的活性部位以外與酶結合，其結合與底物沒有競爭關系反競爭性抑制：抑制劑I僅與復合物ES作用生成底物-酶-抑制劑復合物SEI9. 酶分子定向進化的原理是什么？從一

40、個或多個已存在的親本出發，利用TaqDNA多聚酶不具有35校對功能，并結合基因工程現有技術，在待進化的酶基因的PCR擴增反應中，配合適當條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，并構建突變庫。并憑借定向選擇（篩選）方法，獲得具有某些預期特征的進化酶，從而排除其它方向的突變體。 10. 酶分子的親和標記物分為哪兩類，各自具有什么特點？KS型不可逆抑制劑：具有與底物類似的結構，他們能與特定的酶結合，它們的結構中還帶有一個活潑的化學基團，可以與酶分子中的必需基團起反應，使酶活力受到抑制Kcat型不可逆抑制劑：結構中潛在著一種化學活性基團，當酶把它們作為一種底物來結合并在這一酶促催化作用進行到一定階

41、段以后，潛在的化學基團被活化，成為有活性的化學基團，并和酶蛋白活性中心發生共價結合，使酶失活11. 按照操作方式，酶反應器可以分為哪幾類，各自具有什么特點？間歇式反應器：先把酶和底物一次性裝入反應器，在適當溫度、PH下反應，經一定時間后將全部反應物取出。此法靈活性大，適合小批量、多品種的生產，并且由于充分攪拌，使反應罐內底物和產物濃度、溫度、PH處處相等且底物和產物濃度隨反應時間而變化半連續式反應器：將底物溶液緩慢加入反應器而非一次性加入。此法可以避免酶反應過程的底物抑制現象連續式反應器：一邊連續地將底物溶液加入反應器中，一邊連續地使反應液以相同流量排出反應器。此法便于自動控制、反應條件恒定、

42、產品質量穩定，所以適用于連續的大規模生產，但處理雜菌污染比較困難12. 與天然酶相比，抗體酶的優點有哪些？專一性和穩定性更強、催化作用機制不同、能催化一些天然酶不能催化的反應13. 抗體酶的制備方法有哪些？ 誘導法、引入法、拷貝法、抗體庫法 微生物工程一、 專業符號1. BOD 生化需氧量2. COD 化學需氧量3. UV 紫外線4. FN 快中子5. PEG 聚乙二醇6. EDTA 乙二胺四乙酸7. GSH 谷胱甘肽8. MFA 代謝通量分析9. MCA 代謝控制分析二、 名詞解釋1. 微生物工程（Microbial Engineering）利用微生物的生長和代謝活動來生產各種有用物質的工程

43、技術，是生物工程的重要組成部分2. 自然選育利用微生物在一定條件下自發突變的原理，通過分離、篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產水平的菌株，能達到純化、復壯菌種，穩定生產的目的3. 誘變育種有意識的將微生物暴露于物理的、化學的或生物的誘變因子中，促使生物體發生突變，進而從突變體中篩選具有優良性狀的突變株的過程4. 葡萄糖效應有些葡萄糖的分解產物，雖然不導致pH下降，但它能阻遏或抑制某些產物合成所必需的酶的形成或酶的活性，即發生葡萄糖效應5. 生理酸性物質這種經微生物生理作用(代謝)后能形成酸性物質的無機氮源(如硫酸銨)稱為生理酸性物質6. 生理堿性物質經菌體代謝后能產生堿性物質的無機氮源(

44、如硝酸鈉)稱為生理堿性物質7. 前體在微生物合成抗生素過程中，有些化合物能被微生物直接利用來構成抗生素分子結構的一部分，而化合物本身的結構沒有大的變化，這些物質稱為抗生素的前體。8. 生長因素某些微生物生長所必需的有機物質，但其需要量不大，通常把這些特殊的營養物質稱為生長因子。常用生長因子有：維生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶。9. 誘變劑能提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑10. 基因突變指遺傳物質（DNA或RNA）中的核苷酸順序突然發生了穩定的可遺傳的變化11. 基因重組（Gene recombination）指兩個不同性狀個體的遺傳基因轉移到一個個體細胞內，并經過基因的重新組合后，造成菌種變異，

45、形成新的遺傳型個體的方式12. 原生質體融合用脫壁酶處理將微生物細胞壁出去，制成原生質體，再用聚乙二醇（PEG）促進原生質體發生融合，從而獲得融合子，這一技術叫原生質體融合13. 原生質體的再生原生質體在再生培養基上重新長出細胞壁，以恢復細胞原有的形態和功能14. 表型變異微生物在生活條件發生改變時，發生暫時的形態、生理等特性的改變，但隨著環境條件的復原，它們又恢復了原有的特性，這種變異沒有使遺傳物質發生任何變化，而僅是表型的改變，是不可遺傳的變異15. 代謝工程代謝工程是指利用多基因重組技術有目的地對細胞代謝途徑進行修飾、改造，改變細胞特性，并與細胞基因調控、代謝調控及生化工程相結合，為實現

46、構建新的代謝途徑，生產特定目的產物而發展起來的一個新的學科領域。16. 次級代謝產物次級代謝產物是指微生物代謝過程中所產生的其自身生長繁殖所不需要的物質。17. 初級代謝產物微生物代謝過程中所形成的為自身生長繁殖所必需的營養物質為初級代謝產物三、 填空題1. 微生物產品的下游加工過程包括 發酵液的預處理 、初步純化 、 高度純化（精制） 、 和 成品加工 。2. 發酵工業中常用的滅菌方法包括 加熱滅菌法 、 輻射滅菌法 、 介質過濾除菌法 、 和 化學滅菌法 。3. 發酵過程中監控的化學參數主要有 PH 、 基質濃度 、 溶解氧濃度 、 氧化還原電位 、 產物濃度 、 廢氣中的氧濃度和 廢氣中

47、的CO2濃度 。4. 誘變育種中使用的誘變劑分為 物理誘變因子 、化學誘變劑 和 生物誘變劑 。四、 問答題1. 常見的菌種保藏方法有哪些?斜面低溫保藏法、液體石蠟封藏法、甘油冷凍保藏法、真空冷凍干燥保藏法、液氮超低溫保藏法、其他干燥保藏法2. 發酵過程中產生泡沫會帶來哪些不利因素，常用的消沫方法有哪幾種？不利因素：發酵罐的裝料系數減小，氧傳遞系數減小等。泡沫過多時，影響更為嚴重，可能會造成大量逃液，發酵液從排氣管路或軸封逃出而增加染菌機會等，嚴重時通氣攪拌也無法進行，菌體呼吸受到阻礙，導致代謝異?；蚓w自溶消沫方法：機械消沫、消沫劑消沫3. 發酵培養基由哪些成分組成？碳源、氮源、無機鹽、微量

48、元素、水、前體、生長因子和發酵物刺激物等4. 培養基按照組成物質來源可分為哪兩種，各自具有什么特點？合成培養基：所用原料的化學成分明確、穩定，但營養單一且價格昂貴，用這種培養基進行實驗重現性好、低泡、呈半透明，適用于研究菌種基本代謝和過程的物質變化，不適用于大規模工業生產。天然培養基：它的原料是一些天然的動植物產品，如花生餅粉、酵母膏、蛋白胨等。天然培養基的特點是營養豐富，適合于微生物的生長繁殖和目的產物的合成。一般天然培養基中不需要另加微量元素、維生素等物質，且組成培養基的原料來源豐富，價格低廉，適用于工業生產。但由于天然培養基的組分復雜，不易重復，故若對原料質量等方面不加控制會嚴重影響生產

49、的穩定性。 5. 下游處理過程分為那幾個步驟？相應的分離方法有哪些？下游加工過程分為：發酵液的預處理、初步純化、高度純化（精制）、成品加工單元操作:絮凝、固-液分離、細胞破碎、沉淀、吸附、膜分離、萃取、離子交換、電泳、結晶、色譜分離、濃縮、干燥、包裝等6. 簡單敘述原生質融合的步驟 標記菌株的篩選：兩株親本必須帶有不同的遺傳標記 原生質體的制備：細菌放線菌溶菌酶；酵母菌霉菌蝸牛酶、纖維素酶菌體需先經過預處理；選擇對數生長期后期的菌體；選擇合適的酶濃度、酵解時間、酵解溫度（2040）；添加滲透壓穩定劑 原生質體的融合：PEG和Ca2+ 原生質體的再生：必須使用再生培養基 融合子的選擇7. 原生質

50、體制備過程中，加入滲透壓穩定劑的作用是什么，常用的穩定劑有哪些？原生質體對溶液和培養基的滲透壓很敏感，必須在高滲或等滲透壓的溶液或培養基中才能維持其生存，低滲透壓溶液中，原生質體將會破裂而死亡。細菌或放線菌：蔗糖、丁二酸鈉 酵母菌：山梨醇、甘露醇 霉菌：KCl、NaCl一定濃度的Ca2+、Mg2+等二價陽離子可增加原生質膜的穩定性，高滲培養基中不可缺少8. 原生質融合過程中PEG和Ca2+分別起什么作用？PEG可使原生質體的膜電位下降，然后，原生質體通過Ca2+離子交聯而促進凝集。另外，PEG的脫水作用，擾亂了分散在原生質膜表面的蛋白質和脂類的排列，提高了脂類膠粒的流動性，從而促進了原生質體融

51、合。9. 原生質體融合育種過程中，雜種菌株的篩選要注意什么？原生質體融合后會產生兩種情況：一種是真正的融合，即產生雜合二倍體或單倍重組體；另一種是暫時的融合，形成異核體。兩者均可在選擇培養基上生長，前者較穩定，后者不穩定，會分離成親本類型。因此，必須在融合體再生后，進行幾代自然分離、選擇，才能確定是否獲得了真正融合子10. 誘變育種中使用的化學誘變劑根據作用方式分為哪幾類？（1）烷化劑類化合物：它能與一個或幾個核酸堿基起反應，引起DNA復制時堿基配對的轉換而發生遺傳變異，這是一類在誘變育種中普遍使用的化學誘變劑。如氮介（NM）、乙烯亞胺（EI）、硫酸二乙酯（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、亞

52、硝基胍（NTG）、亞硝酸（HNO2）等。 （2）堿基類似物：它們能夠摻入到DNA分子中而引起遺傳變異。如5-溴尿嘧啶（5-Bu）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、5-氨基尿嘧啶、6-氯胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、6-氯嘌呤和8-氮鳥嘌呤等類似物。堿基類似物誘發基因突變可導致堿基對的轉換，這種誘變易產生回復突變。（3）誘變劑插入（移碼誘變劑）：包括吖啶黃、吖啶橙等吖啶類化合物。這類化合物的平面三環結構可插入DNA雙螺旋的鄰近堿基對之間，造成DNA鏈上堿基的添加或缺失，從而造成堿基突變點后全部遺傳密碼轉錄和翻譯錯誤，引起菌種變異。11. 在發酵過程中引起溶解氧異常下降的常見原因有哪些？.污染了好氣性雜菌，大

53、量的溶氧被消耗；.菌體代謝發生異?，F象，需氧要求增加，使溶氧下降；.某些設備或工藝控制發生故障或變化，如攪拌功率消耗變小或攪拌速度下降等，也可能引起溶氧的下降。12. 代謝網絡中的節點是什么？可以分為幾類？代謝網絡分流處的代謝產物稱為節點，其中對終產物起決定作用的少數節點稱為主節點。根據節點下游分支的可變程度，分為柔性、剛性及半柔性節點 柔性節點：由節點流向各分支的代謝流分率隨代謝要求發生相應的變化，去除產物的反饋抑制后，該分支的代謝流分率大大增加 剛性節點：由節點流向某一分支或某些分支的代謝流分率是難以改變的，這是由產物的反饋抑制及對另一分支酶的激活的相互作用所致的 半柔性節點：介于兩者之間，由該節點流向各分支的代謝流中有一個是占主導地位的，其酶活性較高或對代謝的親和力較大，且無反饋抑制，通過削弱主導分支的酶量或酶活可增加產物的產率動物細胞工程一、專業符號：專心-專注-專業Hela 人宮頸癌上皮細胞系 Vero綠猴腎細胞CHO中國倉鼠卵巢細胞DMSO二甲亞砜 MTT四唑鹽 EGF表皮生長因子 NGF神經生長因子BSS生理平衡鹽溶液 PEG聚乙二醇 HAMA 人抗鼠抗體反應 CDR互補決定區 McAb 單克隆抗體 ES 胚胎干細胞 ScFv 單鏈抗體t-PA組織纖溶酶原激活劑 FCM流式細胞分析技術TK胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型HGPR