1、免疫組化技術(shù)簡介免疫組化技術(shù)簡介CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制基本概念基本概念 應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)( i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y, I H C ) 或 免 疫 細 胞 化

2、 學(xué) 技 術(shù)(immunocytochemistry, ICC)。免疫組化免疫組化基本概念基本概念抗原（抗原（Antigen, Ag）一類能刺激機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，即產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞等，并能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細胞在體內(nèi)或體外特異性結(jié)合的物質(zhì)。抗體（抗體（Antibody, Ab）機體受抗原刺激后由B淋巴細胞，特別是漿細胞分泌產(chǎn)生的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的球蛋白，稱為免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。基本概念基本概念抗體的結(jié)構(gòu)抗體的結(jié)構(gòu)V區(qū)氨基酸的種類和排列順序千變?nèi)f化，故可形成許多種具有不同結(jié)合抗原特異性的抗體。（抗原特異性，第一抗體）C區(qū)氨基酸的組成和排列

3、在同一種屬動物Ig同型L鏈和同一類H鏈中都比較恒定。制備第二抗體的重要基礎(chǔ)。一抗：鼠抗人一抗：鼠抗人二抗：羊抗鼠二抗：羊抗鼠基本概念基本概念單克隆抗體單克隆抗體由同一克隆細胞產(chǎn)生，針對抗原分子上某一單個抗原決定簇的特異性抗體。多克隆抗體多克隆抗體由不同細胞產(chǎn)生，其免疫化學(xué)特性不同，能夠識別抗原表面多種抗原決定簇的多種抗體的混合物。基因工程抗體基因工程抗體在基因水平上對Ig分子進行切割、拼接或修飾，甚至是在人工全合成后導(dǎo)入受體細胞表達產(chǎn)生的新型抗體。CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制基本原理基本原理抗原抗原顯色顯色抗體抗體間接

4、法間接法直接法直接法PAP法法LSAB法法基本原理基本原理顯顯色系統(tǒng)色系統(tǒng)酶免疫組化染色中的常用的酶及顯色酶免疫組化染色中的常用的酶及顯色底物底物辣根過氧化物酶/HRP：DAB、AEC堿性磷酸酶/AP ：AP-Red、NBT/BCIP酶酶的的選擇選擇HRP染色結(jié)果比AP染色結(jié)果保存時間長含有內(nèi)源性HRP的組織切片：首選標(biāo)記酶為APAP和HRP結(jié)合可進行雙重或3重免疫組化標(biāo)記，對比清晰CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制操作流程操作流程CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點05結(jié)果判讀06失敗原因0

5、7質(zhì)量控制技術(shù)要點技術(shù)要點免疫原理的選擇免疫原理的選擇一抗一抗（屬種、單/多抗、濃縮/即用型）二二抗抗（屬種、標(biāo)記方法）顯顯色方式色方式技術(shù)要點技術(shù)要點取材取材組織切片：組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）；大小（110.5cm）；取病變組織與正常組織交界處；避免對組織標(biāo)本的損傷和擠壓。印片：印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織 (經(jīng)新鮮標(biāo)本最大面積剖開，充分暴露病灶，將載玻片輕輕壓與組織切面，細胞粘附于玻片上，然后固定）（缺點是細胞分布不均勻，細胞有重疊）各種體液、穿刺液：各種體液、穿刺液：可直接涂片（血液、組織液等）或離心后涂片（細胞少腦脊液、腹水等）。培養(yǎng)細胞：培養(yǎng)細胞：懸浮細胞離心后涂片

6、；貼壁細胞可爬片。 取材時間要早（取材時間要早（24小時以內(nèi)），避免組織自溶，使抗原變性消失或嚴重彌散。小時以內(nèi)），避免組織自溶，使抗原變性消失或嚴重彌散。 組織切塊厚度不易超過組織切塊厚度不易超過0.5cm，以便固定液的及時滲透及，以便固定液的及時滲透及脫水。脫水。技術(shù)要點技術(shù)要點固定固定目的目的：凝固蛋白，終止細胞內(nèi)酶的作用，防止細胞自溶；固定細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)；保持組織細胞的抗原性；防止細胞層脫落；去除細胞內(nèi)的脂類（妨礙抗體結(jié)合）；防腐。注意事項：注意事項：組織塊不宜過大；固定液的量一般以組織塊大小的30倍為宜；必須選擇對組織滲透力強，同時又不致使組織過度收縮或膨脹的試劑；固定時間一般以24

7、小時為宜。固定液的選擇：固定液的選擇：所有的標(biāo)本固定必須根據(jù)其性質(zhì)及所進行的組織化學(xué)反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌Ｈ缂状肌⒈⒓兹⒁掖嫉取＜兹┕潭ê螅乖兹┕潭ê螅乖菀妆蝗菀妆谎谏w，掩蓋，形成醛鍵或羧甲基，使蛋白交聯(lián)封閉部分抗原表位。形成醛鍵或羧甲基，使蛋白交聯(lián)封閉部分抗原表位。技術(shù)要點技術(shù)要點石蠟切片石蠟切片優(yōu)點：優(yōu)點：對組織結(jié)構(gòu)形態(tài)保存好，對組織的定位很準(zhǔn)確，是觀察組織和細胞結(jié)構(gòu)的理想方法，可以用于回顧性研究。缺點：缺點：抗原常被封閉和破壞。對抗原的保存不如冰凍切片。冰凍切片冰凍切片優(yōu)點：優(yōu)點：能避免石蠟切片因固定，脫水，浸蠟等對抗原的損失，較好的保存組織抗原的免疫活性，適用于不穩(wěn)定的抗

8、原。缺點：缺點：不易保存（-80）；細胞內(nèi)易形成冰晶而破壞抗原結(jié)構(gòu)，造成抗原的彌散使定位不準(zhǔn)確。能做石蠟切片的就能做冰凍切片，能做冰凍切片的不一定能做能做石蠟切片的就能做冰凍切片，能做冰凍切片的不一定能做石蠟切片！石蠟切片！技術(shù)要點技術(shù)要點抗原修復(fù)抗原修復(fù)免疫組化在制片的過程中由于廣泛的蛋白交聯(lián)而使其組織的某些抗原決定簇發(fā)生遮蔽、致使免疫細胞化學(xué)的信號減弱或消失等不良效應(yīng)。使遮蔽的組織抗原決定簇重新暴露的方法，即抗原修復(fù)抗原修復(fù)。抗原修復(fù)常用方法：抗原修復(fù)常用方法：酶修復(fù)法（胰蛋白酶、胃蛋白酶和無花果酶）；熱修復(fù)（高壓修復(fù)、微波爐修復(fù)、煮沸法）技術(shù)要點技術(shù)要點抗體的保存抗體的保存分裝密封保存，

9、避免對抗體的污染并注明標(biāo)記（批號、名稱、效價、量）根據(jù)廠家提供的保存條件保存避免反復(fù)凍融而使抗體效價降低CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制結(jié)果判讀結(jié)果判讀必須設(shè)立對照必須設(shè)立對照陽性組織對照陰性組織對照陰性試劑對照（空白對照；替代對照；吸收試驗；抑制試驗）自身對照沒有對照染色的免疫組化染色結(jié)果是不可信的！沒有對照染色的免疫組化染色結(jié)果是不可信的！結(jié)果判讀結(jié)果判讀抗原表達必須在特定部位抗原表達必須在特定部位陽性標(biāo)記細胞學(xué)陽性標(biāo)記細胞學(xué)特征特征可分為胞膜型；胞核型；胞質(zhì)(漿)型；微絨毛型；復(fù)合型（胞膜-胞質(zhì)兼有，胞核-胞質(zhì)兼有，

10、或微絨毛-胞質(zhì)兼有）等五種陽性細胞類型。這與抗原所在部位相關(guān)聯(lián)，但應(yīng)注意排除因組織固定不好引起的抗原彌散假象，尤其是復(fù)合型圖像。不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。結(jié)果判讀結(jié)果判讀陰性結(jié)果不能視為抗原不表達陰性結(jié)果不能視為抗原不表達由于檢測方法靈敏度有高低之分，有時可因染色方法靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)，判斷時應(yīng)注意。盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細胞的陽性表達，特別是盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細胞的陽性表達，特別是酶免疫酶免疫標(biāo)記標(biāo)記因為這類陽性著色多系內(nèi)源干擾，或系人為因素所致。對免疫組化標(biāo)記結(jié)果的意義不能對免疫組

11、化標(biāo)記結(jié)果的意義不能絕對化絕對化應(yīng)結(jié)合臨床資料、X線等影像學(xué)及實驗結(jié)果綜合分析。結(jié)果判讀結(jié)果判讀非非特異染色特異染色免疫組化染色過程中產(chǎn)生的非靶抗原的呈色結(jié)果，屬假陽性，又稱背景著色，能嚴重干擾免疫組化染色結(jié)果的正確判斷，應(yīng)竭力避免或減輕。原因原因涉及免疫組化染色流程的各個環(huán)節(jié)，可來自： 內(nèi)源性干擾(自發(fā)熒光、內(nèi)源酶、內(nèi)源性生物素等)；試劑污染(質(zhì)量差，交叉反應(yīng)，F(xiàn)c受體干擾等)；組織處理不當(dāng)(組織固定不及時或固定不良所導(dǎo)致的抗原彌散移位、洗滌不充分所導(dǎo)致的游離試劑殘留等)。特異性染色特異性染色非特異性染色非特異性染色分布在特定的部位分布在特定的部位, , 具結(jié)構(gòu)性具結(jié)構(gòu)性無分布規(guī)律，常出現(xiàn)在

12、切片邊緣、刀痕無分布規(guī)律，常出現(xiàn)在切片邊緣、刀痕或皺折部位及壞死或擠壓的細胞區(qū)域或皺折部位及壞死或擠壓的細胞區(qū)域 由于細胞內(nèi)抗原含量不同，所以顯色不由于細胞內(nèi)抗原含量不同，所以顯色不均一均一不限于單個細胞，而是累及一片細胞，不限于單個細胞，而是累及一片細胞，均勻顯色均勻顯色陽性與陰性細胞相互交雜，同一切片上陽性與陰性細胞相互交雜，同一切片上顯色強度不一顯色強度不一細胞和周圍的結(jié)締組織均無區(qū)別的著色細胞和周圍的結(jié)締組織均無區(qū)別的著色結(jié)果判讀結(jié)果判讀結(jié)果表示結(jié)果表示著色程度（抗原含量）著色程度（抗原含量）弱陽性（+）1分中等陽性（+）2分強陽性（+）3分陽性細胞數(shù)量陽性細胞數(shù)量弱陽性（+ ，指陽性

13、細胞數(shù)在25%以下）1分中等陽性（+,指陽性細胞數(shù)在25%49%) 2分強陽性（+ ，指陽性細胞數(shù)在50%以上) 3分目前多采用積分綜合計量。計算公式：目前多采用積分綜合計量。計算公式：兩者相乘（或相加）。大多主張兩者相乘（或相加）。大多主張4者為陽性，者為陽性，6者為強陽性，者為強陽性，至少隨機觀察至少隨機觀察5-10個個HPF，取其均值。，取其均值。以免疫酶標(biāo)記（HRP- DAB/H2O2）為例：則表現(xiàn)為淡黃色細顆粒淡黃色細顆粒、棕黃色顆棕黃色顆粒粒和褐黃色粗顆粒褐黃色粗顆粒，后者耀眼易見。圖像攝影，原則上多取強陽性區(qū)域。CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制失敗原因失敗原因假陰性常見假陰性常見原因原因失敗原因失敗原因假陽性假陽性常見常見原因原因CONTENTS目錄01基本概念02基本原理03操作流程04技術(shù)要點05結(jié)果判讀06失敗原因07質(zhì)量控制質(zhì)量控制質(zhì)