1、微量克氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量微量克氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康膌掌握微量克氏定氮法定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理掌握微量克氏定氮法定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和操作技術(shù)。和操作技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理l天然含氮有機(jī)化合物（如蛋白質(zhì)）與濃硫酸共熱時(shí)分天然含氮有機(jī)化合物（如蛋白質(zhì)）與濃硫酸共熱時(shí)分解出氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。在克氏定氮儀中解出氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。在克氏定氮儀中加入強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸氣加入強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸氣蒸餾法將氨蒸入無(wú)機(jī)酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液蒸餾法將氨蒸入無(wú)機(jī)酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液進(jìn)行滴定，滴定

2、所用無(wú)機(jī)酸的量（進(jìn)行滴定，滴定所用無(wú)機(jī)酸的量（molmol）相當(dāng)于被測(cè)）相當(dāng)于被測(cè)樣品中氨的量（樣品中氨的量（molmol），根據(jù)所測(cè)得的氨量即可計(jì)算），根據(jù)所測(cè)得的氨量即可計(jì)算樣品的含氮量。樣品的含氮量。 l因?yàn)榈鞍踪|(zhì)含氮量通常在因?yàn)榈鞍踪|(zhì)含氮量通常在16%16%左右，所以將克氏定左右，所以將克氏定氮法測(cè)得的含氮量乘上系數(shù)氮法測(cè)得的含氮量乘上系數(shù)6.256.25，便得到該樣品，便得到該樣品的蛋白質(zhì)含量。的蛋白質(zhì)含量。 l 整個(gè)反應(yīng)過(guò)程可分為消化、蒸餾及滴定三大步整個(gè)反應(yīng)過(guò)程可分為消化、蒸餾及滴定三大步驟。驟。 l 樣品與濃硫酸共熱時(shí)，分解出氮、二氧化碳和樣品與濃硫酸共熱時(shí)，分解出氮、二氧化碳

3、和水，氮轉(zhuǎn)變出的氨，進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸水，氮轉(zhuǎn)變出的氨，進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨，此過(guò)程通常稱之為銨，此過(guò)程通常稱之為“消化消化”。 l但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以加快反應(yīng)速度。以甘氨酸為例，其消化過(guò)程可表示如下：以加快反應(yīng)速度。以甘氨酸為例，其消化過(guò)程可表示如下： CH3NH2COOH + 3H2SO4 3CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 CH3NH2COOH + 3H2SO4 3CO2 + 3SO

4、2 + 4H2O + NH3 （1 1） 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO42NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 （2 2） (NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 (NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 （3 3） l 反應(yīng)（反應(yīng)（1 1）、（）、（2 2）在克氏定氮燒瓶中完成。反應(yīng)（）在克氏定氮燒瓶中完成。反應(yīng)（3 3）在克氏定氮儀內(nèi)進(jìn)行。在克氏定氮儀內(nèi)進(jìn)行。 l濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨。借水蒸氣將濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨。借水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸餾到定量、定濃度的硼酸溶液

5、中，氨與溶液中產(chǎn)生的氨蒸餾到定量、定濃度的硼酸溶液中，氨與溶液中的氫離子結(jié)合生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然的氫離子結(jié)合生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定至恢復(fù)溶液中原來(lái)氫離子濃度為止。后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定至恢復(fù)溶液中原來(lái)氫離子濃度為止。最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)計(jì)算出待測(cè)物中的總氮量。 三、實(shí)驗(yàn)器材l1 1微量克氏定氮儀：參見(jiàn)圖微量克氏定氮儀：參見(jiàn)圖5-15-1，1 1套套/ /組。組。l2 2克氏定氮燒瓶：克氏定氮燒瓶：2 2只只/ /組。組。 3取樣器：，5mL、1 mL各1只/組。 使用指南：接好套頭（不漏氣）

6、使用指南：接好套頭（不漏氣）通過(guò)旋鈕調(diào)節(jié)容量通過(guò)旋鈕調(diào)節(jié)容量（如（如500500表示表示5mL5mL）用活塞第一擋吸液用活塞第一擋吸液用活塞第一擋用活塞第一擋和第二擋放液和第二擋放液換套頭換套頭繼續(xù)使用。注意，平時(shí)取樣器繼續(xù)使用。注意，平時(shí)取樣器應(yīng)掛在架子上，絕不可倒置，以免溶液倒流入槍體中而應(yīng)掛在架子上，絕不可倒置，以免溶液倒流入槍體中而損壞儀器。損壞儀器。 l4 4電爐：公用。電爐：公用。 l5 51 1微量滴定管（微量滴定管（5 mL5 mL）：）：1 1只只/2/2組。組。 l6 6酒精燈：酒精燈：1 1只只/ /組。組。 l7 7錐形瓶（錐形瓶（100 mL100 mL）：）：4 4

7、只只/ /組。組。 l8 8鐵架臺(tái)、十字夾、龍爪、打火機(jī)、表面皿、吸管、量鐵架臺(tái)、十字夾、龍爪、打火機(jī)、表面皿、吸管、量筒等。筒等。 五、實(shí)驗(yàn)操作五、實(shí)驗(yàn)操作l. .消化：將兩個(gè)消化：將兩個(gè)50mL50mL的克氏定氮燒瓶編號(hào)（在燒瓶的克氏定氮燒瓶編號(hào)（在燒瓶口附近），一只燒瓶?jī)?nèi)加口附近），一只燒瓶?jī)?nèi)加1.0mL1.0mL蒸餾水，作為空白。蒸餾水，作為空白。另一只燒瓶?jī)?nèi)加入另一只燒瓶?jī)?nèi)加入1.0mL1.0mL樣液（卵清蛋白液）。然后樣液（卵清蛋白液）。然后用取樣器各加濃硫酸用取樣器各加濃硫酸2mL2mL（取濃硫酸時(shí)勿濺到衣物和（取濃硫酸時(shí)勿濺到衣物和皮膚上，也不要灑到實(shí)驗(yàn)桌上），用藥勺加硫酸鉀皮

8、膚上，也不要灑到實(shí)驗(yàn)桌上），用藥勺加硫酸鉀硫酸銅混合物約硫酸銅混合物約20mg20mg（不必稱重，一點(diǎn)點(diǎn)即可），所（不必稱重，一點(diǎn)點(diǎn)即可），所有試劑要盡量加到克氏定氮燒瓶的底部。燒瓶口插上有試劑要盡量加到克氏定氮燒瓶的底部。燒瓶口插上小漏斗（作冷凝用），燒瓶置通風(fēng)櫥內(nèi)的電爐上加熱小漏斗（作冷凝用），燒瓶置通風(fēng)櫥內(nèi)的電爐上加熱消化，參見(jiàn)圖消化，參見(jiàn)圖5-35-3，注意先啟動(dòng)抽風(fēng)機(jī)。消化時(shí)間為，注意先啟動(dòng)抽風(fēng)機(jī)。消化時(shí)間為2 24h4h。在消化時(shí)可以同時(shí)進(jìn)行第二步。在消化時(shí)可以同時(shí)進(jìn)行第二步。 消化裝置l. .蒸餾：取蒸餾：取100mL100mL錐形瓶錐形瓶3 3只，洗滌干凈，用取樣器各加只，洗滌

9、干凈，用取樣器各加入入2%2%硼酸溶液硼酸溶液5.0mL5.0mL，加入幾滴指示劑，溶液顯紫色，用，加入幾滴指示劑，溶液顯紫色，用l表面皿蓋好備用。如錐形瓶?jī)?nèi)液體呈綠色，需重新洗滌。表面皿蓋好備用。如錐形瓶?jī)?nèi)液體呈綠色，需重新洗滌。 l安裝好微量克氏定氮儀。微量克氏定氮儀實(shí)際上是一套蒸安裝好微量克氏定氮儀。微量克氏定氮儀實(shí)際上是一套蒸餾裝置，注意保證每個(gè)夾子夾緊而不漏氣，保證加樣口餾裝置，注意保證每個(gè)夾子夾緊而不漏氣，保證加樣口的小漏斗口朝上并斜靠在定氮儀上（這可以通過(guò)調(diào)整其下的小漏斗口朝上并斜靠在定氮儀上（這可以通過(guò)調(diào)整其下方夾子的方位來(lái)實(shí)現(xiàn)）。方夾子的方位來(lái)實(shí)現(xiàn)）。 la)a)蒸餾瓶的洗滌

10、蒸餾瓶的洗滌l l參見(jiàn)圖參見(jiàn)圖5-65-6，將自來(lái)水由，將自來(lái)水由5 5經(jīng)經(jīng)7 7注入到蒸餾瓶夾層注入到蒸餾瓶夾層2 2（即蒸汽（即蒸汽發(fā)生室）中，使水面達(dá)到蒸餾瓶頸部的轉(zhuǎn)彎處。把裝有蒸發(fā)生室）中，使水面達(dá)到蒸餾瓶頸部的轉(zhuǎn)彎處。把裝有蒸餾水的錐形瓶餾水的錐形瓶9 9置于冷凝器置于冷凝器4 4下方，并將冷凝器下方的導(dǎo)管下方，并將冷凝器下方的導(dǎo)管1212下端插入錐形瓶液面以下，再將少量蒸餾水由漏斗下端插入錐形瓶液面以下，再將少量蒸餾水由漏斗3 3注注入到蒸餾瓶的反應(yīng)室入到蒸餾瓶的反應(yīng)室1 1中，把所有夾子夾緊，打開(kāi)冷凝水。中，把所有夾子夾緊，打開(kāi)冷凝水。用酒精燈用酒精燈1111將蒸餾瓶夾層將蒸餾瓶

11、夾層2 2內(nèi)的水煮沸，然后移去火源，內(nèi)的水煮沸，然后移去火源，錐形瓶錐形瓶9 9中的蒸餾水就會(huì)從冷凝器下方的導(dǎo)管中的蒸餾水就會(huì)從冷凝器下方的導(dǎo)管 1212倒流到蒸倒流到蒸餾瓶的反應(yīng)室餾瓶的反應(yīng)室1 1內(nèi)，再倒流至蒸餾瓶的夾層內(nèi)，再倒流至蒸餾瓶的夾層2 2中，由廢液排中，由廢液排出口出口8 8排出。按照上述方法將儀器洗滌排出。按照上述方法將儀器洗滌2 23 3次。最后，反次。最后，反應(yīng)室應(yīng)室1 1中的余液可以按下法清空：把所有夾子夾緊，將蒸中的余液可以按下法清空：把所有夾子夾緊，將蒸餾瓶夾層餾瓶夾層2 2內(nèi)的水煮沸，先移去錐形瓶?jī)?nèi)的水煮沸，先移去錐形瓶9 9，然后移去火源，然后移去火源，反應(yīng)室反

12、應(yīng)室1 1中余液將倒流至夾層中余液將倒流至夾層2 2中，由中，由7 7排出。以后每次在排出。以后每次在做下一次蒸餾之前都要先將蒸餾瓶洗滌做下一次蒸餾之前都要先將蒸餾瓶洗滌2 23 3次，并將反應(yīng)次，并將反應(yīng)室室1 1清空。清空。lb)b)空白和樣品的蒸餾空白和樣品的蒸餾 把裝有把裝有5.0mL5.0mL的的2%2%硼酸溶液的錐形瓶硼酸溶液的錐形瓶9 9置于冷凝器的下方，將冷凝器下置于冷凝器的下方，將冷凝器下方的導(dǎo)管方的導(dǎo)管1212下端插入液面以下，錐形瓶?jī)?nèi)須事先加入指示劑（注意下端插入液面以下，錐形瓶?jī)?nèi)須事先加入指示劑（注意此時(shí)的顏色，它將是后面滴定終點(diǎn)的顏色）。先將克氏燒瓶中消化此時(shí)的顏色，

13、它將是后面滴定終點(diǎn)的顏色）。先將克氏燒瓶中消化好了的空白消化液由小漏斗好了的空白消化液由小漏斗3 3注入到蒸餾瓶的反應(yīng)室注入到蒸餾瓶的反應(yīng)室1 1中，用蒸餾水中，用蒸餾水洗滌克氏燒瓶洗滌克氏燒瓶2 2次（每次約次（每次約2mL2mL），洗滌液皆由漏斗），洗滌液皆由漏斗3 3注入反應(yīng)室注入反應(yīng)室1 1。用取樣器取用取樣器取40%40%氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液10mL10mL，注入小漏斗（小漏斗必須始終保，注入小漏斗（小漏斗必須始終保持口朝上的狀態(tài)），放松夾子，使其緩緩流入反應(yīng)室持口朝上的狀態(tài)），放松夾子，使其緩緩流入反應(yīng)室1 1。當(dāng)小漏斗內(nèi)。當(dāng)小漏斗內(nèi)仍有少量仍有少量NaOHNaOH溶液時(shí)，立即

14、夾緊夾子（以上操作勿將溶液時(shí)，立即夾緊夾子（以上操作勿將NaOHNaOH溶液濺到溶液濺到衣物和皮膚上，也不要灑到實(shí)驗(yàn)桌上）。再加約衣物和皮膚上，也不要灑到實(shí)驗(yàn)桌上）。再加約3mL3mL蒸餾水于小漏斗蒸餾水于小漏斗內(nèi)，同樣緩緩放入反應(yīng)室，并留少量水在漏斗內(nèi)作水封。把所有夾內(nèi)，同樣緩緩放入反應(yīng)室，并留少量水在漏斗內(nèi)作水封。把所有夾子夾緊，打開(kāi)冷凝水，開(kāi)始用酒精燈加熱，將蒸餾瓶夾層子夾緊，打開(kāi)冷凝水，開(kāi)始用酒精燈加熱，將蒸餾瓶夾層2 2內(nèi)的水煮內(nèi)的水煮沸。注意，在樣品蒸餾的整個(gè)過(guò)程中，要保持火苗的穩(wěn)定，嚴(yán)禁中沸。注意，在樣品蒸餾的整個(gè)過(guò)程中，要保持火苗的穩(wěn)定，嚴(yán)禁中途移去火源，以防倒吸。從蒸餾瓶?jī)?nèi)的

15、水溶液沸騰開(kāi)始計(jì)算時(shí)間，途移去火源，以防倒吸。從蒸餾瓶?jī)?nèi)的水溶液沸騰開(kāi)始計(jì)算時(shí)間，大約大約10min10min即可蒸餾完畢。將導(dǎo)管即可蒸餾完畢。將導(dǎo)管1212的下端抽出液面，繼續(xù)蒸餾的下端抽出液面，繼續(xù)蒸餾1min1min，使導(dǎo)管內(nèi)的余液落回錐形瓶使導(dǎo)管內(nèi)的余液落回錐形瓶9 9中，移開(kāi)錐形瓶，用表面皿蓋好等待滴中，移開(kāi)錐形瓶，用表面皿蓋好等待滴定。移去火源，反應(yīng)室定。移去火源，反應(yīng)室1 1中的殘液將會(huì)倒流至夾層中的殘液將會(huì)倒流至夾層2 2中，由中，由8 8排出。將排出。將蒸餾瓶洗滌蒸餾瓶洗滌2 23 3次，并將反應(yīng)室次，并將反應(yīng)室1 1清空，按空白蒸餾的方法進(jìn)行樣品清空，按空白蒸餾的方法進(jìn)行樣

16、品蒸餾。蒸餾。 改良式微量克氏定氮儀各部示意圖 l. .滴定：參見(jiàn)圖滴定：參見(jiàn)圖5-65-6，將微量，將微量滴定管先后用蒸餾水和滴定管先后用蒸餾水和0.01mol/L0.01mol/L的的HClHCl溶液潤(rùn)洗，用溶液潤(rùn)洗，用洗耳球?qū)⑾炊驅(qū)?.01mol/L0.01mol/L的的HClHCl溶液溶液吸入微量滴定管中，滴定錐形吸入微量滴定管中，滴定錐形瓶中的硼酸液至呈淡葡萄紫色瓶中的硼酸液至呈淡葡萄紫色（也就是前面加了指示劑后的（也就是前面加了指示劑后的標(biāo)準(zhǔn)硼酸溶液的顏色）。記錄標(biāo)準(zhǔn)硼酸溶液的顏色）。記錄所耗所耗HClHCl溶液毫升數(shù)。溶液毫升數(shù)。 l. .再次將蒸餾瓶洗滌干凈，拆卸克氏定氮儀裝置，清洗再次將蒸餾瓶洗滌干凈，拆卸克氏定氮儀裝置，清洗所使用過(guò)的所有玻璃儀器，清洗取樣器套頭，整理好桌面所使用過(guò)的所有玻璃儀器，清洗取樣器套頭，整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收，上的