1、江蘇農林職業技術學院 畢 業 設 計論 文SNL/QR7.5.4-3 植物組培中污染菌初探專 業 生物技術及應用 學生姓名 沈 永 恒 班 級 14生物技術及應用1班 學 號 202111130119 指導教師 宋 剛 完成日期 2021年6月 成績評議學號202111130119姓名 沈永恒 題目 植物組培中污染菌初探 指導教師建議成績： 評閱教師建議成績： 辯論小組建議成績： 院辯論委員會評閱意見及評定成績：辯論委員會主任簽字蓋章： 年 月 日畢業設計論文任務書姓名沈永恒學號202111130119班級14生物技術及應用1班題目植物組培中污染菌種類初探 設計(論文)主要內容本文主要研究在植

2、物組培中污染菌的種類、引起污染的原因以及防治的方法。重點研究問題污染菌種類以及防治污染的方法主要技術指標死對頭其它要說明的問題指導老師意見 指導教師簽字： 年 月 日指導教師意見 對論文的簡短評價：1.指出論文存在的問題及錯誤2.對創造性工作評價3.建議成績 優 良 中 及格 不及格 指導教師簽字 年 月 日評閱教師意見 對論文的簡短評價：1.指出論文存在的問題及錯誤2.對創造性工作評價3.建議成績 優 良 中 及格 不及格 評閱教師簽字 年 月 日辯論小組評議意見學號202111130119姓名 沈永恒 題目 植物組培中污染菌初探 辯論小組意見： 1、對論文的評價2.建議成績等級 優 良 中

3、 及格 不及格3.需要說明的問題 辯論小組長簽字 年 月 日植物組培中污染菌初探江蘇農林職業技術學院 句容 212400摘要：本文主要歸納了在植物組織培養中的污染菌類型、特征以及引起污染的原因和防治污染的方法。文章中主要是細菌類污染、真菌類污染以及病毒類污染，其中以真菌類污染比較常見。本文還給出了防止污染的方法，僅供參考。關鍵詞：植物組培；污染；污染防治A preliminary study on the species of contaminated bacteria in plant tissue culture (Jiangsu Polytechnic College of Agricu

4、lture and Forestry, Jurong, Jiangsu 212400)Abstract: This paper mainly summarizes the types of bacteria contamination in plant tissue culture method, causes and prevention and control of pollution caused by pollution characteristics as well. The article is mainly bacteria pollution, fungi pollution

5、and viral contamination, the fungi pollution is relatively common. This paper gives a method to prevent pollution, for reference.Key words: plant tissue culture; pollution; pollution control目 錄1.引言12. 植物組培污染原因12.1離體植物自身的污染12.2外在環境的污染13. 植物組培污染微生物種類13.1真菌23.2病毒23.3細菌34.植物組培污染防治方法3 4.1對接種人員的要求4 4.2對接種

6、環境的要求44.3對器具的要求44.4對培養基的要求54.5對培養瓶的要求54.6對接種材料和接種環境的要求54.6.1對外植體的消毒54.6.2參加抗生素64.6.3操作間的消毒65.結束語6參考文獻7致謝81引言隨著科技的開展，植物組培技術越來越受到人們的重視，也發揮著越來越大的作用。植物工廠化的育苗、挽救瀕臨滅絕的珍貴植物、減少病蟲害、完善基因庫等等都離不開植物組培這一重要技術。雖然植物組織培養操作是在無菌環境中完成的，但是也因為外植體帶菌、滅菌不徹底、操作不標準等錯誤帶來一系列的污染。污染帶來的危害有很多，比方導致初代培養失敗，繼代培養增殖系數低，試管苗死亡或者是生長速度慢，玻璃化加劇

7、，移栽困難，成活率低，甚至失敗1。對于工廠化生產加大了工廠化生產的本錢、減少了利潤、延誤了時間、浪費了資源、延緩了工作效率等。 植物組織培養是利用細胞全能性的特點，在無菌條件下，將離體的植物的器官、組織、原生質體培養于人工調配的適合生長的培養基中，在培養基中生根、分化、增殖最后形成完整植株的過程。植物組培的接種、培養苗的轉移和繼代等都是在無菌的環境下進行。無菌環境的好與壞滅菌時間的長短都是造成污染的主要原因，這也是研究和工廠化生產的關鍵所在。因此，保證培養材料和培養基的無菌狀態及培養室的良好清潔條件，是植物組培成功的最根本的前提2。2植物組培污染原因植物組培污染是指培養物在培養過程中因溫度、P

8、H值、濕度、光照、適宜的營養條件等符合其他微生物生長，不利于組培苗生長的，導致在培養過程中產生一系列污染。這些污染一般出現在材料外表、材料附近的培養基以及培養基的其他部位，表現為霉變、混濁或云霧狀、粘液狀、發酵泡沫狀等不同形狀、顏色和大小的污染痕跡 3。2.1離體植物自身的污染植物組培中的培養材料大局部都是從自然界天然的環境中選取的，有的取自土壤外表，有的那么是取自土壤的外表以下局部，有的取自于樹木及花草等。例如：植物的莖葉、馬鈴薯、植物的果實或種子。在取材料的過程中往往會出現意外損傷培養材料的外表，使空氣中的孢子或者是土壤中的微生物菌進入了培養材料的內部而引起的污染。2.2外在環境的污染由于

9、接種室內空氣滅菌不徹底使其室內帶菌量太大，接種人員的手部清洗不干凈、隨意大聲講話和培養基滅菌不當導致的不同程度的污染。3植物組培污染微生物種類在植物組培過程中，導致污染的病原菌種類大致分為真菌類、病毒類以及細菌類。在這三類中真菌和細菌類占的比例比較大。詳見以下圖1圖1.植物組培污染比例圖引自百度圖片3.1真菌圖2.真菌污染圖真菌是沒有葉綠素的真核微生物，除少數種類是單細胞外,絕大多數是由多細胞組成的。真菌在地球上廣泛存在于空氣、水、土壤以及各類生物的體表或體內。在室內常附著在物體外表，能自動或隨人的活動而擴散于四周。真菌種類豐富，分布廣泛，繁殖快速，無處不在。真菌污染在培養基中是呈絨毛狀、絮狀

10、，界限不太明顯，有許多不同顏色的孢子，在接種后的4-8天內開始從外植體處長白毛。真菌污染在培養過程中是最多的。真菌喜歡溫暖潮濕的環境，而培養基恰恰給它提供了這樣的環境，真菌所產生的孢子隨空氣飄蕩，假設不慎落入培養基中，一粒孢子足以污染整個培養基。酵母菌屬外界污染，菌落多為乳白色，少數為紅色，個別為黑色主要來源于工作人員。假設在培養基中出現了真菌，可以利用顯微鏡進行檢測，觀察孢子的形態，有無細胞壁的形成。一些情況下，真菌污染也可以用DNA探針做鑒定。詳見圖23.2病毒病毒是一種只含有DNA或RNA的遺傳印子，有很強的寄生能力，病毒顆粒特別微小以納米為測量單位所以病毒污染的概率比較小。病毒污染難于

11、發現，要用電子顯微鏡才可以觀察到，所以在工廠化生產挑污染的時候，不僅投入了大量的精力、物力、財力，而且還過于麻煩。由于病毒一般潛伏在細胞體內，不會導致整個細胞培養死亡。一般用莖尖分生組織培養來進行脫毒，當然我們在實驗室也可用根尖分生組織的。病毒類污染的鑒定是利用DNA有同源性而做探針偵測4。3.3細菌圖3.細菌污染圖引自百度圖片在我們生存環境的四周，細菌是所有生物中數量最多的一類，包括我們人類自身。它無孔不入，泥土里、水里、空氣里都有散布，或者和其他生物共生，形狀不同，大小不一。細菌污染的特點為在培養基外表或材料外表出現黏液狀、菌落或者是渾濁的水跡狀并伴有刺鼻氣味，有時甚至出現泡沫發酵狀，一般

12、在接種1-4天內即能發現。它主要來源于接種工具鑷子、剪刀滅菌不徹底或是呼吸排出的細菌，有時由于接種人員的粗心大意，手接觸到了接種瓶的瓶口，致使微生物落入，也有時剪到了帶菌的植株又未發現，直接剪下一瓶植株而導致的。另外，培養室空間比較大、溫度又高、空氣濕度也比較高也會增加污染的概率。在接種過程中，可以利用生化反響鑒定細菌類污染。詳見圖34 植物組培污染防治方法植物組培污染原因是多種多樣的，沒有固定的方法去整治植物組培污染菌。因此，防治組培苗污染也應多方面考慮，只有確保每個環節的正確進行，才能使工業化生產或者研究產生最小的本錢5。4.1對接種人員的要求圖4. 某組培企業接種人員管理制度 操作方面的

13、污染首先要從工作人員的衛生入手，操作人員應及時剪除指甲、勤洗澡的良好衛生習慣，進入無菌區時不能佩戴戒指，不要吃東西，不能喝水以及禁止吸煙。工作服里外要分開，里面的只能在實驗室穿，嚴禁外穿。在進入無菌區前應換好拖鞋，每天用消毒水拖地，工作服在休息的時候要清洗消毒，口罩、帽子要戴好，一次性用品及時更換，進入無菌室前要用肥皂洗手，進入培養室用75%的酒精對雙手進行消毒。工作時禁止大聲講話，大幅度走動，以免帶動空氣中的孢子。詳見圖44.2對接種環境的要求接種室要保持干凈衛生，應每天清掃一遍。每天接種完畢后要用甲酚皂對工作臺及接種室消毒。定期檢查超凈工作臺污染情況，紫外燈損壞時要及時更換，每次使用工作臺

14、前，應先用巴氏消毒水擦拭工作臺內壁，然后用75%的酒精噴灑培養基和接種苗。翻開工作臺的紫外燈照射20分鐘左右。接種室內的空調應定期清理，由于長時間使用空調而不經常通風，也可以會導致室內真菌污染。有實驗說明不定期清理接種室內的空調比經常清理空調會加重污染6 。4.3對器具的要求接種人員使用的鑷子、剪刀要嚴格按照滅菌標準進行滅菌。每天應將使用過的器具放入滅菌器內滅菌，滅菌后浸泡于95%的酒精中，使用時應在酒精燈火焰上灼燒三遍，灼燒一次應沾一些酒精再次灼燒，直至灼燒三遍。每剪完一瓶或兩瓶母苗時要進行灼燒。這樣就大大減少了器具帶菌的導致污染的概率。4.4對培養基的要求培養基是植物組織培養的根底。根據不

15、同的培養物應該配制不同的培養基，培養基在配制時要配置準確無誤，沒有滅菌的培養基里面有含有許多雜菌，假設不慎接種后會很容易污染，從而加大了工廠化生產的本錢，故培養基應盡快在121、1.41Pa的高壓蒸汽滅菌鍋里面滅菌20-25分鐘，不可超過規定的壓力范圍,否那么培養基中的蔗糖、有機物質、維生素、激素等物質就會分解,導致培養基變質、變色,降低培養基的pH值,使培養基難以凝固 7 。降溫過程不要太過于急躁，切勿翻開排氣閥直接進行放氣處理，有研究通過比照一次和二次排空氣法對培養基的滅菌效果發現，經過兩次排氣滅菌，沒有發生培養基滅菌不徹底現象，而使用一次排氣法進行滅菌時，有時會發生因無法排凈滅菌鍋內空氣

16、而使培養基滅菌不徹底8。4.5對培養瓶的要求培養瓶應盡量選擇為廣口玻璃瓶，有利于在滅菌器具內滅菌，滅菌后應冷卻至室溫方可取出，以防炸裂傷害到工作人員。如果選擇的是專用的塑料瓶，應仔細觀察該瓶可以接受的最高溫度及壓強，該培養瓶符合滅菌條件的可以直接滅菌，如假設不符合，那么用化學殺菌的方法來滅菌，這樣就彌補不能高壓滅菌的缺陷。4.6 對接種材料要求外植體的選擇是組培中的關鍵因素之一，因此取材應以春夏生長旺季，最好是當年生的嫩梢為佳，應盡量選擇晴天，防止陰雨天氣，因中午有強烈的太陽光，陽光中的紫外線有利于殺菌，或者取離體枝梢在潔凈空氣條件下抽芽，然后從新生組織中取材接種。在選取時要注意選擇再生能力比

17、較強、遺傳穩定、滅菌容易的外植體。另外，胚也是一個很好的外植體材料，在接種材料不太好找的冬天，可以利用植物果實或種子中的胚獲得接種材料。4.6.1對外植體的消毒外植體大局部取自大自然，外表附著大量的微生物，在接種前必須將外植體所帶的菌殺滅，為了不影響其生長，又不能損傷外植體，所以外植體的消毒是植物組培工作中重要的環節。為到達最正確消毒效果,對于材料內部帶菌的組織,有時還需在培養基中參加適量抗生素8 。 外植體消毒時切不可生搬硬套，要根據材料的大小、幼嫩程度、質地等，選擇適宜的消毒劑種類、使用濃度和消毒時間，消毒的最正確效果以殺死材料上的所有微生物，而又對材料的損傷最小為好9。消毒果實、種子之前

18、應先檢查一下外表有無破損處或者是為了保鮮而涂抹的蠟質。如果無蠟質直接可以用無菌水沖洗，假設有蠟質，那么先用70%酒精浸泡2分鐘，然后放進2%的次氯酸鈉溶液中浸泡。最后去除果皮，用內生組織或種子接種即可。根和塊莖這兩種材料一般都常年生長在有大量微生物的土壤環境中，帶菌量比較多，故消毒應謹慎徹底。先用小細毛軟毛刷子清洗外表，切不可用力和使用硬毛刷子，以防損傷外表。洗刷完畢后，用酒精溶液浸泡30秒，取出，再次浸泡于二氯化汞溶液中5分鐘，使用時用無菌水沖洗，然后用無菌紗布或者無菌紙吸干即可。葉片從樹枝上摘取后，先用水沖洗掉葉上面的灰塵或者是動物的糞便，然后用酒精浸泡約30s，在用二氯化汞浸泡5分鐘然后

19、用無菌水沖洗3次，消毒后的葉片在無菌的條件下既可以接種。4.6.2參加抗生素培養基中參加抗生素是為了防止內生菌造成的污染，提高培養成功的概率。在組培中，常常因為污染而丟棄成百上千的污染物，采用適當的抗生素可以節省大量的的財力、物力、人力以及時間。常用的抗生素有鏈霉素、青霉素、慶大霉素、四環素、氯霉素、卡那霉素等，用量一般為5-20mg/L9。在使用抗生素時要明確抑制病菌的種類，使用的抗生素是否對培養的植物組織有不良影響以及抗生素的使用濃度和處理時間。高濃度的抗菌素會傷害植物材料，引起對生長的抑制或畸變。而且抗生素通常只能抑制細菌生長而不能完全殺滅細菌。需要引起重視的是，抗生素有可能會引起微生物

20、產生抗性突變體，使潛伏的污染對植物以后的生長造成影響10。要值得提醒的是，不要以為有了抗生素這一試劑，而放松或放棄滅菌的想法，此外，抗生素要有選擇的使用，不可盲目使用，否那么容易導致植物不太適應而停止生長。4.6.3操作間的消毒長期未使用的操作間，使用前應先清掃干凈，然后關閉室內窗戶，按其甲醛和高錳酸鉀的比例配制消毒水，然后使用電爐慢慢加熱，不可直接升至高溫。消毒后，緊閉室內門窗1周即可使用。或者利用甲酚皂溶液和高錳酸鉀進行室內徹底消毒，及時清理污染材料，污染過的培養瓶應在高壓滅菌器里面滅菌前方可使用。5結束語植物組織培養目前所面臨的問題是組培苗的污染，也是當今組培行業的一大難題，而污染又是多種多樣的，研究者們一直在努力解決污染的課題。不同植物污染不同，只有在組織培養過程中高度重視，嚴格管理控制好每個環節的污染問題，才能降低污染率。隨著科學技術不斷開展和進步，將會出現更高效、節能的新設備、新技術、新方法應用于組織培養技術，從而有效的控制污染的發生，研究生產出更多更好的植物。參考文獻1 鞏振輝，申書.植物組織培養第二版M.北京：化學工業出版社，2021.2 謝鳳琦，張金蓮，董新玉.植物組織培養中常見病原菌種類及污染控制措施J.現代農業科技,2021(2):182-183. 3 屈云慧,楊春梅,蔣亞蓮.花卉組織培養中污染的發生與防治J.北方園藝，2007(8): 188