1、PPT制作：杜雨濛、張佳佳、陳靚限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶切割原理、切割原理、方法、結果分析及應用方法、結果分析及應用課堂內容回顧：1、定義：、定義： 1、定義：、定義：限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶是可以識別是可以識別特特定的定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵進行切割的進行切割的一一類酶類酶，簡稱限制酶。，簡稱限制酶。2、分類：、分類：型酶：具有型酶：具有DNA修飾的作用在非特異位點處切割修飾的作用在非特異位點處切割DNA。型酶：是最重要的工具酶型酶：是最重要的工具酶能在能在DNA分子內部的特異

2、分子內部的特異位點識別和切割位點識別和切割DNA雙鏈，所雙鏈，所 以通常所說的限制以通常所說的限制性內切酶就指這一類酶。性內切酶就指這一類酶。型酶：與型酶：與型酶一樣，具有限制與修飾活性，其切型酶一樣，具有限制與修飾活性，其切割位點很難預測割位點很難預測型酶：具有DNA修飾的作用在非特異位點處切割DNA。型酶：型酶：是最重要的工具酶能在DNA分子內部的特異位點識別和切割DNA雙鏈，所 以通常所說的限制性內切酶就指這一類酶。型酶：與型酶一樣，具有限制與修飾活性，其切割位點很難預測。3、命名：、命名：規則規則：第一個字母（大寫）：取自該酶的細胞屬名第一個字母（大寫）：取自該酶的細胞屬名第二、三個字

3、母（小寫）：該細胞的種名第二、三個字母（小寫）：該細胞的種名第四個字母（羅馬數字）：代表同一菌株中第四個字母（羅馬數字）：代表同一菌株中 不同限制性內切酶的編號不同限制性內切酶的編號例如：例如：EcoR、Hind 等等等等限制性核酸內切酶切割原理1、類和類和類酶：類酶： 在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。的存在。類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而，而類酶在識別位點上切割類酶在識別位點上切割DNA分子，然后從底物上解離。分子，然后從底物上解離

4、。2、類由兩種酶組成：類由兩種酶組成： 一種為限制性內切核酸酶（限制酶），它切一種為限制性內切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列；割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。別序列。類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組是重組DNA的基礎。絕大多數的基礎。絕大多數類限制酶識別長度為類限制酶識別長度為4至至6個核苷酸的個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列，產生回文對稱特異核苷酸序列，產生5或或3黏性末端（也有一些產生平端或黏性末端（也有一些產生平端或鈍端）鈍端）

5、 幾種限制性內切酶的切割位點幾種限制性內切酶的切割位點例如：3、同工異源酶：來源不同但能識別和切割同一位、同工異源酶：來源不同但能識別和切割同一位點的酶。如：點的酶。如：BamH和和Bst，Xho和和Pae R7等可以相互代替使用。等可以相互代替使用。4、同尾酶：識別序列不同，但產生相同末端的限、同尾酶：識別序列不同，但產生相同末端的限制性內切酶。如：制性內切酶。如：BamH和和Sau3A等由此產等由此產生的生的DNA片段可借黏性末端相互連接，操作是具片段可借黏性末端相互連接，操作是具有更大的靈活性。有更大的靈活性。通過 使 用 (15 種 )限 制 性 內 切 酶 酶 切 重 組質粒，說明限

6、制性內切酶的應用和限制性內切酶酶切圖譜分析的方法o方法：1.質粒的構建質粒的構建 采用聚合酶鏈反應chainreaction，PCR)方法擴增出 MLCKcDNA 片段，插入質粒 pBKrsv中，構建成 pBKrsv-MLCK 重組質粒2.酶切、構建、片段的純化和連接酶切、構建、片段的純化和連接 按Maniatis等方法進行。3.重組質粒的轉化重組質粒的轉化 轉化采用“熱休克”法。4.重組質粒的提取重組質粒的提取 挑取陽性克隆，在LB培養基中培養，采用堿裂解法提取重組質粒。5.定量定量 取5LDNA溶液用4.5l去離子水稀釋，用紫外分光光度計比色，讀取AZ60和AZ80吸光度值，計算出AZ60

7、/AZ80比值，按下列公式計算質粒DNA濃度,本實驗中質粒DNA濃度為1.0g/L。質粒 DNA 濃度(g/L)=AZ60X稀釋度/Z0=AZ60X56.重組質粒的限制性核酸內切酶酶切重組質粒的限制性核酸內切酶酶切 取0.5ml離心管15只，分別加入質粒 2l(2g)，依 次 加 入 限 制性內 切 酶 Acc I、Apal I、Ava H、Bgl I、BglH、Nco I、OxanI、Puv H、PpUM I、SalI、Ssp I、SstI、Xba I、Hind皿、EcoR I各0.5微升及相 應的 NEBuffer2L、BSAL、去離子水 13.5L、 混勻、點動離心，37 水浴孵育2小時

8、。7、配置配置1.5的瓊脂糖凝膠的瓊脂糖凝膠 稱取瓊脂糖0.6g, 加入 1XTAE 緩 沖 液 40 ml置 微 波 爐 中,中 火120s，熔化后冷卻至60，加入3L10g/l溴化乙錠，混勻，倒入插好梳子的模具中，凝固后放入電泳槽中。電泳槽中加入1TAE緩沖液。8、電泳電泳 取酶切產物8l與DNA上樣緩沖液2l混勻，進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可觀察到橘紅色DNA條帶，結果如圖Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit.結果重組質粒重組質粒pBKrsv-MLCK pBKrsv-MLCK 全長全長7378bp7378bp

9、，通過通過 DNAstarDNAstar軟件分析獲得各酶酶切位點的信息軟件分析獲得各酶酶切位點的信息，選擇在插入片段中單獨存在和在插入片段與質選擇在插入片段中單獨存在和在插入片段與質粒序列中均含有的限制性內切酶酶切位點，計粒序列中均含有的限制性內切酶酶切位點，計算酶切后片段大小的理論值經各種限制性內切算酶切后片段大小的理論值經各種限制性內切酶酶切后，獲得不同大小的片段，經電泳分析酶酶切后，獲得不同大小的片段，經電泳分析與理論設計完全一致與理論設計完全一致。結果分析限制性內切酶酶譜分析往往用于對構建的重組質粒進行初分析所獲得的信息將有助于確定構建是否成功及其插入片段的方向(orientation

10、)l在選擇限制性內切酶時,應選擇在插入片段中單獨存在和在插入片段與質粒序列中均含有的限制性內切酶酶切位點,這樣可保證酶切片段大小能滿足進一步分析的需要。在進行限制性內切酶實驗時首先應進行 D N A的定量，1 U 酶的限制性內切酶活性指在一定時間內(60min)適當溫度下和建議使用的緩沖液中,在50l反應體系中,將1g底物 DNA 完全消化所需要的酶量l單位活性依所用底物的不同而不同,使用其他底物時,應根據情況確定所用酶量l根據本實驗室的經驗,1g底物 DNA 加入 5 U 的限制性內切酶在2h時間內可以酶切完全，通常延長消化。實驗中可能出現的實驗中可能出現的問題及其討論問題及其討論解決方法解

11、決方法1.標準底物檢測酶活性2.將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA3.檢查反應系統是否最佳4.換用對DNA甲基化不敏感的同類酶酶解，重新將質粒DNA轉化至dcm-,dam-基因型的細菌菌株5.換用不同切割非甲基化位點的同類酶消化DNA，重新將質粒轉至dcm+,dam+菌株中擴增6.將DNA底物與DNA混勻進行切割驗證7.換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證一一.如果如果DNA完全沒有被內完全沒有被內切酶切割？切酶切割？1.內切酶失活2.DNA不純，含有SDS，酚，EDAT等內切酶抑制因子3.條件不適（試劑、溫度）4.DNA酶切位點上的堿基被甲基化5.DNA酶切位點沒有甲基化(如Dpn1)6

12、.DNA位點上存在其它修飾7.DNA不存在該酶識別順序解決方法解決方法二二.如果如果DNA切割不完全？切割不完全？1.內切酶活性下降2.內切酶稀釋方法不正確3.DNA不純，反應條件不佳4.內切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾5.部分DNA溶液粘在管壁上6.內切酶溶液粘度大，取樣不準7.酶切后DNA粘性末端退火8.由于反應溶液、溫度使內切酶變性9.過度稀釋使酶活性降低10.反應條件不適11.識別位點兩側插入了可影響酶切效率的核酸順序1.用5-10倍量過量消化2.用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶3.同上4.同上5.反應前離心數秒6.將內切酶稀釋，增大取樣體積7.電泳前將樣品置65保溫5

13、-10分鐘，取出后置冰浴驟冷8.使用標準反應緩沖液及溫度9.適當稀釋酶液，反應液稀釋的酶不能貯藏10.使用最佳反應體系11.加大酶量5-10倍1.用DNA作底物檢查酶切結果2.電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段三三.如果如果DNA片段數目片段數目多于理論值？多于理論值？1.其它內切酶污染2.底物中含其它DNA雜質解決方法解決方法限制性核酸內切酶的限制性核酸內切酶的應用應用l用于DNA基因組物理圖譜的組建l基因的定位和基因分離lDNA分子堿基序列分析l比較相關的DNA分子和遺傳工程u 將水稻葉綠體的將水稻葉綠體的DNADNA，用，用EcoR1EcoR1限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶消

14、化后，消化后，放入含有溴化乙錠的低熔點（放入含有溴化乙錠的低熔點（LMPLMP）的）的1%1%瓊脂糖凝膠中做電泳瓊脂糖凝膠中做電泳分離。從分離。從LMPLMP中分離出分子大小為中分離出分子大小為1.8-2.5kb1.8-2.5kb之間的之間的DNADNA片段，片段，再與同樣經過再與同樣經過EcoR1EcoR1限制性核制性內切酶限制性核制性內切酶切割并用堿性磷酸酶切割并用堿性磷酸酶做了脫磷酸化處理的做了脫磷酸化處理的pBR322pBR322質粒連接，然后將混合物轉移到大質粒連接，然后將混合物轉移到大腸桿菌腸桿菌53465346菌株，培養在氨芐青霉素選擇板上，形成菌株，培養在氨芐青霉素選擇板上，形

15、成AmprAmpr轉化轉化子菌落群體。這樣就構成了由子菌落群體。這樣就構成了由EcoREcoR 限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶切割的切割的水稻水稻DNADNA基因組庫。用基因組庫。用AmprAmpr轉化子菌落與轉化子菌落與32P32P放射性標記的放射性標記的psbA psbA DNADNA探針做菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。從這些探針做菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。從這些陽性克隆體中分離出來的重組體質粒陽性克隆體中分離出來的重組體質粒DNADNA，經進一步的分析，經進一步的分析，就能測出水稻葉綠體基因就能測出水稻葉綠體基因psbApsbA的序列。的序列。應用一應用二u 利用利用pBR322pBR322作為載體作為載體重組人體的抑生長激素重組人體的抑生長激素也是一也是一個經常提到的應用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組個經常提到的應用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組大同小