1、附錄XII A 無菌檢查法無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。假設(shè)供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅說明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。無菌檢查應(yīng)在干凈度萬級下的局部干凈度百級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)展，其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按?醫(yī)藥工業(yè)干凈室區(qū)懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法?的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展干凈度驗證。隔離系統(tǒng)應(yīng)按相關(guān)的要求進(jìn)展驗證，其內(nèi)部環(huán)境的干凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進(jìn)展監(jiān)控。無菌檢查人員必

2、須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備：培養(yǎng)基按以下處方制備，亦可用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225避光的環(huán)境，假設(shè)保存于非密閉容器中，一般可在3周內(nèi)使用；假設(shè)保存于密閉容器中，一般可在1年內(nèi)使用。1、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基酪胨胰酶水解 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化鈉 2.5gL-胱氨酸 0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0mL硫乙醇酸鈉 0.5g 或硫乙醇酸 0.3mL瓊脂 0.75g 水 1000mL除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)pH值為弱堿性，

3、煮沸，濾清，參加水葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)pH值使滅菌后為7.10.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)完畢后培養(yǎng)基氧化層粉紅色不超過培養(yǎng)基深度的1/2，滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否那么，須經(jīng)1000水浴加熱至粉紅色消失不超過20分鐘后，迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。2、改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基胨 5.0g 磷酸氫二鉀 1.0g酵母浸出粉 2.0g 硫酸鎂 0.5g葡萄糖 20.0g 水 1000mL除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)pH值約為6.8，煮沸；參加putaotang 溶解后，搖勻，濾清，調(diào)pH值使滅菌后為6.4

4、0.2，分裝，滅菌。3、選擇性培養(yǎng)基按上述硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基或改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前參加適宜的中和劑、滅活劑或外表活性劑，其用量同方法驗證試驗。4、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基胨 10.0g 氯化鈉 5.0g牛肉浸出粉 3.0g 水 1000mL取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)pH值為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)pH值使滅菌后為7.20.2，分裝，滅菌。5、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法，參加14.0g瓊脂，調(diào)pH值使滅菌后為7.20.2，分裝，滅菌。6、改進(jìn)馬丁瓊脂培養(yǎng)基按改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，參加14.0g瓊脂，調(diào)pH值使滅菌后為6.40.2，分裝，滅菌。培養(yǎng)基的適

5、用性檢查 無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進(jìn)展。培養(yǎng)基的無菌性檢查 每批培養(yǎng)基隨機抽取不少于10支瓶，5支瓶置3035、另5支瓶置2025培養(yǎng)14天，均應(yīng)無菌生長。靈敏度檢查菌種 培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代從菌種保藏中心獲得的冷凍枯燥菌種為第0代，試驗用菌種應(yīng)采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)展保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。金黃色葡萄球菌staphylococcus aureusCMCCB26003銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaCMCCB101

6、04枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisCMCCB63501生孢梭菌Clostridium sporogenesCMCCB64941白色念珠菌Candida albicansCMCCF98001黑曲霉Aspergillus nigerCMCCF98003菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基中或改進(jìn)馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，2025培養(yǎng)2448小時，上述培養(yǎng)物用0.9%氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)小于100C

7、FU菌落形成單位的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改進(jìn)馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，2328培養(yǎng)57天，參加35mL無菌的含0.05%ml/ml聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用無菌的含0.05%ml/ml聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100CFU的包子懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小室內(nèi)使用，假設(shè)保存于28可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。培養(yǎng)基接種 取每管裝量為12mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，

8、另1支不接種，作為空白對照，置3035培養(yǎng)3天；取每管裝量為9mL的改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接種，作為空白對照，置2025培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。結(jié)果判定 空白對照管應(yīng)無菌生長，假設(shè)加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判斷該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。稀釋液、沖洗液及制備方法稀釋液、沖洗液配制后應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。(1)稱取蛋白胨1.0g，加水1000mL，微溫溶解，濾清，調(diào)pH值至7.10.2，分裝，滅菌。(2)pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，稱取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000

9、mL，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。(3)0.9%氯化鈉溶液 稱取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000mL，過濾，分裝，滅菌僅用于上述2種溶液不適合時使用。根據(jù)供試品的特性可選用其它經(jīng)歷證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后參加外表活性劑或中和劑等。方法驗證試驗當(dāng)建立產(chǎn)品的無菌檢查法時是，應(yīng)進(jìn)展方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。假設(shè)該產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應(yīng)重新驗證。驗證時，按“供試品的無菌檢查的規(guī)定及以下要求進(jìn)展操作。對每一試驗菌應(yīng)逐一進(jìn)展驗證。菌種及菌液制備 同培養(yǎng)基靈敏度檢查薄膜過濾法 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種

10、的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中參加小于100CFU的試驗菌，過濾。將培養(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，參加等量試驗菌，作為對照，細(xì)菌置3035、真菌置2025培養(yǎng)35天，逐日觀察各濾筒內(nèi)試驗菌的生長情況。直接接種法 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定量的供試品量，另1管作為對照，細(xì)菌置3035、真菌置2025培養(yǎng)35天

11、，逐日觀察各濾筒內(nèi)試驗菌的生長情況。結(jié)果判定 與對照管比擬，如含供試品的各容器中的試驗菌均生長良好，那么說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)展供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，那么說明供試品的改檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)展方法驗證試驗。驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進(jìn)展。供試品的無菌檢查抽驗數(shù)量 系指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量支或瓶。成品每亞批均應(yīng)進(jìn)展無菌檢查。除另有規(guī)定外，

12、原液、半成品及成品按表1規(guī)定，上市產(chǎn)品監(jiān)視檢驗按表2規(guī)定。接種量 系指每個最小包裝的最小取樣量mL或g。除另有規(guī)定外，接種供試品量按表3規(guī)定。假設(shè)采用直接接種法，按接種量要求等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基中兩種培養(yǎng)基的接種支瓶數(shù)之比為2：1；假設(shè)采用薄膜過濾法，應(yīng)采用三聯(lián)薄膜過濾器，其中兩聯(lián)參加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，另一聯(lián)參加改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基。只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的內(nèi)容物全部過濾。陽性對照 以金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌。供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照試驗的菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查項下金黃色葡萄球菌菌液制備方法，加菌量小于100CF

13、U。陽性對照液可在供試品無菌檢查培養(yǎng)14天后，取其中1份硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，參加小于100CFU陽性對照菌，作為陽性對照。陽性對照置3035培養(yǎng)4872小時應(yīng)生長良好。陰性對照 供試品無菌檢查時，應(yīng)取相應(yīng)溶劑、稀釋液和沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。無菌試驗過程中，假設(shè)需要使用外表活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對微生物生長無毒性。無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品的無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應(yīng)與驗證的方法一樣。操作時，用適宜的消毒液對供試品容器外表進(jìn)展徹底消毒。如果供試品容器內(nèi)有一定的真空度，可用適

14、宜的無菌器材如帶有除菌過濾器的針頭向容器內(nèi)導(dǎo)入無菌空氣，再按無菌操作啟開容器，取出內(nèi)容物。供試品處理及接種培養(yǎng)基除另有規(guī)定外，按以下方法進(jìn)展。1、薄膜過濾法采用封閉式薄膜過濾器，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45m，直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試品溶液過濾前先將少量的沖洗液過濾，以濕潤濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分枯燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜外表。供試品溶液經(jīng)濾膜過濾后，假設(shè)需要沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100mL，總沖洗量不得超過1000mL，以防止濾膜上

15、的微生物受損傷。水溶液供試品 取規(guī)定量，每支瓶供試品裝量為5mL及以下者，全部轉(zhuǎn)移至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般不少于3次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法驗證試驗。沖洗后，2個濾器中參加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各100mL，另一濾器中參加改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基。水溶性固體供試品 取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標(biāo)簽說明復(fù)溶，然后照水溶液供試品項下的方法操作。非水溶性供試品 取規(guī)定量，混合溶于含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的稀釋液300mL的無菌容器內(nèi)，充分混合，立即過濾。用含0.1%1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般不

16、少于3次。參加含或不含聚山梨酯80的培養(yǎng)基。其他照水溶液供試品項下的方法操作。可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品 取規(guī)定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯中，劇烈振搖，使供試品充分溶解。如果需要可適當(dāng)加熱，但溫度不得超過44，并趁熱迅速過濾。對仍然無法過濾的供試品，于含有適量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試品溶液中參加不少于100mL的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試品溶液過濾，過濾后濾膜沖洗及參加培養(yǎng)基照非水溶性供試品項下的方法操作。無菌氣噴霧劑供試品 取規(guī)定量，將各容器置至少-20的冰室冷凍至少約1小時。以無菌操作迅速在容器上端鉆一小孔釋放拋射劑后再無菌開啟容器，并將供試

17、品溶液轉(zhuǎn)移至無菌容器中，然后照水容額或非水溶性制劑供試品項下的方法操作。裝有藥物的注射器供試品 取規(guī)定量，將注射器中的內(nèi)容物假設(shè)需要可吸入稀釋液或標(biāo)簽所示的溶劑溶解直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾，然后按水溶性供試品項下方法操作。同時應(yīng)采用直接接種法進(jìn)展包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。2、直接接種法直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進(jìn)展無菌檢查的供試品。取規(guī)定量供試品，等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基中2中培養(yǎng)基的接種支數(shù)或瓶數(shù)之比為2：1。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積，不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培

18、養(yǎng)基每管裝量不少于15mL，改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10mL.培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗證試驗。混懸液等非澄清水溶液供試品 取規(guī)定量，等量分別接種至各管培養(yǎng)基中。固體供試品 取規(guī)定量，參加適宜的稀釋劑溶解，或按標(biāo)簽說明復(fù)溶后混合，等量分別接種至各管培養(yǎng)基中。非水溶性供試品 取規(guī)定量，混合，參加適量的聚山梨酯80或其他適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化；等量分別接種至各管培養(yǎng)基中，或等量分別直接接種至含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的各管培養(yǎng)基中。培養(yǎng)及觀察 將上述接種后的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基平均分成兩份，一份置3035培養(yǎng)14天；另一份與接種后的改進(jìn)馬丁培養(yǎng)基置2025培養(yǎng)14天，培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀

19、察并記錄是否有菌生長。如在參加供試品后或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無菌生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中及營養(yǎng)瓊脂斜面和改進(jìn)馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)2天，真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂和改進(jìn)馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上是否有菌，必要時做菌種鑒定。結(jié)果判定 陽性對照管應(yīng)生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否那么試驗無效。假設(shè)供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；假設(shè)供試品觀眾任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含。當(dāng)符合以下至少一個條件時方可判斷試驗結(jié)果無效：(1)無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。(2)回憶無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。(3)供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因