1、QPCR中常見的問題Q：ROX是什么，有什么作用？A：ROX是一種熒光染料，作為參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由于反應總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號波動都能夠被扣除，使數據真正反映PCR進程。ROX校正能夠極大地改進定量的精確度，提高重復管之間的數據重現性。Q：熒光通道的選擇？A：定量PCR實驗必須使用ROX校正熒光，占去一種熒光。TaqMan探針的淬滅基團(TAMRA)也要占用一種熒光，對于4色檢測的儀器來說，只剩下2種熒光可以標記探針，對于5色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針，

2、由于它的淬滅基團是不發熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標記探針。如果實驗要求不高，不做ROX校正（AB公司不推薦這樣做），還可以再多一種熒光用于標記探針。研究應用本身的要求。如果研究SNP和基因突變，因為絕大多數人類基因是2態的，只存在兩種等位基因，2條探針已經足夠。如果研究基因表達，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個內對照，3色也就足夠了。Q：內標法和外標法哪種數據更精密？ A：是同樣可靠的。內標的優點在于目標基因與管家基因的反應條件最接近一致，缺點在于目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發生競爭與抑制，導致它們的PCR效率有差異。外標的優點在于

3、目標基因與管家基因的引物和探針之間沒有發生競爭與抑制的機會，但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大，也會導致它們的PCR效率有差異。兩相比較，內標法與外標法的數據精確度是一樣的。 熒光定量PCR問題疑難解答Q1. 這兩天我做標準曲線，線性關系還行，R2=0.998。但是擴增效率只有80%另外擴增曲線也不光滑。2.我用SYBR作為熒光染料，樣品的熒光強度也挺低的只有100-200左右。 A：曲線不光滑有時跟染料的量相關，可以加大；或者是擴增產物太少了。 擴增效率差有引物、試劑和PCR條件的原因。可以做溫度梯度摸索實驗，尋找最佳退火溫度（擴增子的影響）；還可以增加Mg離子的濃度；如果其他條件都好

4、了，還不行，那就是引物的原因。樣品稀釋準確很重要，做標準曲線不好的很多原因是倍比稀釋的問題，正常情況10倍比稀釋時前后是相差3.32個循環。 Q：熒光定量PCR的靈敏度？A：對于染料法的熒光定量來說，Cq值在1330之間比較準確，3033之間需要再次確認，在以上范圍內的置信度比較差。 Q：標準曲線要重復兩三次嗎? A：不是，只是用來做標準曲線的梯度點最好不要少于4個，否則標準曲線準確性不高。 Q：關于熒光定量標準曲線的制作？A：一般的儀器雖然聲稱能進行單拷貝檢測，但如果不是特別設計的體系很難做到100拷貝以下的準確定量。一般用來做標準曲線的最小濃度為1000拷貝，再往下可靠性就降低了。這不是稀

5、釋或其他什么問題，而是本身你選作標準曲線的濃度以及定量濃度最好不要低于1000拷貝，100拷貝也勉強可以接受。否則即使做出來，認可度也不會太高。 Q：熔解曲線高矮是什么意思？A：Tm值相同，而峰高低有差異是表達豐度不同。同樣的擴增產物也會出現Tm值有微小差異，一般差異在1度以內都可以接受。熔解曲線的縱坐標表示熒光信號對溫度的一階負導數。 Q：定量PCR沒有擴增？A：把定量PCR的產物跑個電泳看有無產物，如果電泳有條帶說明PCR是成功的，只是熒光信號沒有讀取到，這時要調整染料或探針的濃度。如果電泳沒有條帶，那么還要在定量PCR儀上優化實驗條件。雖然你在普通PCR儀上優化過條件，但換了定量PCR儀

6、，由于兩臺儀器的升降溫速度及溫度精密度等指標存在差異同樣的條件做不出PCR也是可能的。 Q：熒光定量real-timePCR重復性問題？A：建議不要只加1ul，而是稀釋10倍左右然后加10ul這樣有助于改善重復性。 如果你測的是拷貝數重復性不好是很難避免的。我感覺用SYBR green作realtime的誤差還是比較大的，它的優勢在于靈敏度高但如果想精確定量還是比較困難的。探針法特異性最好。 Q：擴增時忘了做熔解曲線了，現在是不是沒法再做融解曲線了？A：把定量PCR產物重新作熔解曲線，只是新建立一個反應，反應條件按照熔解曲線的條件設定就可以了沒必要重新作定量Q：熒光閾值高怎么改進? A：閾值取

7、決于基線，基線是313cycles左右的熒光信號值標準偏差10倍。可能是背景高，把模板純化一下。就可能是模板濃度較高，起峰早導致的閾值線過高。 Q：熒光定量PCR檢測靈敏度和線性范圍的關系？A：一般大家認為的檢測靈敏度即檢測下限，可以理解為能檢測到和準確定量的最低濃度(拷貝數)。而線性范圍為能夠檢測的區間，即可以檢測及分辨的最低濃度到最高濃度的數量級。但兩者都與熒光定量PCR儀器及試劑體系相關。 Q：real time PCR Cq值一般在多少后認為模板沒擴增？A：當進入對數期的循環數大于35個時，RealTime RT-PCR檢測無效基因沒有表達。當進入對數的循環數在32-35個循環時，需要

8、有至少3個重復才能判斷是否能檢測到基因的表達。Q：正常情況NTC是不應該出現Cq值的嗎？ A如果是探針法，應該沒有Cq值。如果是染料法，可能在30個循環后有微弱起峰，并且軟件計算出Cq值。這時還要觀察熔解曲線，看擴增產物是否是引物二聚體。如果溶解曲線的Tm值在80度以下那么很可能是引物二聚體，這時也可以優化條件比如提高退火溫度等。如果溶解曲線是雙峰或更多峰，其中有與加模板后的擴增產物的Tm值相同的峰那么就意味著存在污染。如果是探針法陰性對照起峰肯定是污染。Q：real time PCR無結果，而用產物跑電泳條帶很清楚，什么問題？A：因為加樣的時間太長了，熒光染料暴露時間太長熒光基團淬滅了；出現

9、上述問題還有一種情況，就是熒光PCR儀的熒光采取信號值太低。 如果使用探針法有熒光信號而沒有求出Cq值，可能探針濃度有問題。Q：最佳熒光采集溫度？A：采集熒光的時機不是取決于溫度而是取決于采用的方法。染料法*一般要在延伸階段的末點進行檢測，而72度延伸的效率最高所以采用染料法時大多在72度檢測。如果擴增產物中存在引物二聚體，也有采用更高的讀板溫度比如76度、80度等。TaqMan探針法*由于TaqMan探針是累積熒光，理論上說在任何步驟檢測都可以但目前TaqMan大多采用兩步法，所以在退火的末點進行檢測即可。 分子信標法*就要在退火的末點進行檢測 。 FRET探針法*要在退火時進行熒光檢測 。

10、 Q：定量PCR中質粒作為標準分子為何要線性化？A：因為要檢測的目的基因應該是線性的。而目的基因確是連接在環狀的質粒上的。所以首先需要質粒線性化并保證完全酶切，然后要回收。注意線性化的質粒不容易保存。所以如果有實驗證據證明不線性化的質粒可以用那就可以省去很多事情了。Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.線形化與環狀質粒比較文章 。這篇文章用這個質粒對線性化和非線性化做了

11、比較，從實驗結果看線性化并沒有對標準曲線產生任何改變。但是這篇文章只是擺出了試驗結果并沒有從原理上分析這個實驗結果的原因。因此線性化對于標準曲線的作用并不能以這篇文章的結果來外推。就是說可能需要更多的實驗結果。或者從原理上分析了這篇文章的結果才能得出結論來說明。Q：realtime pcr不同基因之間的閾值(threshold)是不是要一樣啊? A：如果做標準曲線或者相對定量建議閾值還是一樣比較好。而且閾值一般要放置于擴增曲線的指數段，即熒光數據對數坐標軸下的線性段。如果擴增曲線的效率接近，閾值線的位置對于定量結果的影響是微乎其微的。Q：擴增曲線本底不斷升高是什么原因? A：1、試劑質量差是主

12、要原因； 2、模板不純是一個重要原因；Q：只要Cq值大于30都是陰性嗎？A：要與對照品比對才能定性分析。不過一般Cq值大于30結果置信度降低，需要多次確認。 常規修飾基團分子量 5-Biotin405.45 3-TAMARA623.605-(6 FAM)537.46 3-Dabsyl498.49 5-HEX744.13 3-(6 FAM)569.46 5-TET675.24 3-Amino Modifier C3153.07 5-Cy5533.63 3-Amino Modifier C7209.18 5-Cy3507.59 3-Thiol Modifier C3154.12 Q：待測基因的Cq

13、值大多在1825之間，但內參的Cq值很低。第一次做時基本都在10左右，將模板稀釋10倍后第二次的內參照的Cq值還是在1214之間。以這樣的數據分析會影響結果的準確度嗎？A：每次都做陰性對照并且陰性對照Cq為0，那Cq30就肯定不是污染，而是基因表達量低或是模板太稀。內參Cq為1014都正常，沒必要再稀釋模板了。不過內參Cq低于10，結果可能會有偏差。Q：請問下現在的PCR熒光診斷試劑盒里面，國家規定都要求要有臨界陽對照嗎？這些對照品是不是一定要和樣本一起提取呢？還有臨界陽用陽性對照來稀釋來得到可以嗎？A：陽性對照和陰性對照必須要和樣品一起提取，進行平行實驗，這樣才有作為對照的意義。臨界陽性樣品是不能通過陽性對照稀釋的，除非你知道臨界陽性的濃度，經過定量標定將陽性對照稀釋到臨界陽性。 Q：real time PCR結果熔解