1、2005年1月January2005色譜ChineseJournalofChromatographyVol.23No.17678高效液相色譜熒光檢測流速梯度法測定去卵巢小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)張雷，盧英俊，鄧同樂，鄭筱祥(浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，浙江杭州310027)播要：建立了同時檢測去卵巢(OVX)小鼠腦內(nèi)的去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羥色胺(5-HT)3種神經(jīng)遞質(zhì)的高效液相色譜方法。采用的色譜條件為：G,柱分離.熒光檢測器檢測，流動相為0.1mol/L的KH2PO4緩沖液-甲醇(體積比為9：1),設(shè)置單泵流速梯度洗脫。方法的檢測限(S/N=3)均在10nmol/L以下，絕對回收

2、率均在80%以上，樣品日內(nèi)測定蜂面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.03%以下。該方法具有檢測靈敏度高、樣品制備簡便等優(yōu)點(diǎn).對小鼠腦內(nèi)的3種單肢類遞質(zhì)的檢測具有實(shí)用價值。關(guān)鍵詞：高效液相色譜；流速梯度；去甲腎上腺素；多巴胺;5-羥色胺；去卵巢小鼠中圖分類號：O658文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-8713(2005)01-0076-03MeasurementofMonoamineTransmittersintheBrainsofOvariectomizedMiceUsingHighPerformanceLiquidChromatographywithFluorescenceDetectionandGra

3、dientFlowRateElutionZHANGLei,LUYingjun,DENGTongle,ZHENGXiaoxiang(DepartmentofBiomedicalEngineeringofZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)Abstract:Amethodforthedeterminationofnorepinephrine(NE),dopamine(DA)and5-hydroxytryptamine(5-HT)inbrainsofovariectomizedmicewasestablishedbyusinghighperformance

4、liquidchromatographwithafluorescencedetector,aC18columnandagradientflowratedeliveredbyasinglepump.Themobilephasewasamixtureof0.1mol/LKH2PO4andCHjOH(9/1,v/v).Detectionlimitsofthemethodweredeterminedtobelowerthan10nmol/L,absoluterecoverieswereabove80%andtherelativestandarddeviations(RSDs)ofintra-daywe

5、reallwithin3.03%.Themethodhastheadvantagesofhighsensitivityandofsimplesamplepreparation.Shortanalysistimeandbetterseparationofsampleswerealsoobtained.Keywords:highperformanceliquidchromatography；gradientflowrate；norepinephrine；dopamine；5-hydroxytryptamine；ovariectomizedmice單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與腦缺血、鎮(zhèn)痛、學(xué)習(xí)

6、記憶等多種生理過程.具有重要的生理意義。該類神經(jīng)遞質(zhì)包括兒茶酚胺和呼噪胺等.前者主要指去甲腎上腺素TNE）和多巴胺（DA）,后者主要指5-羥色胺（5-HT）。國內(nèi)關(guān)于NE,DA和5-HT3種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測多采用高效液相色譜-電化學(xué)分析法（HPLC-ECD）CS，但由于ECD對流動相變化較為敏感，故較少采用梯度洗脫。梯度洗脫中以流動相的濃度變化最為常見，而以流動相的流速梯度的應(yīng)用在文獻(xiàn)中少有報道。本文采用高效液相色譜-熒光檢測法，嘗試設(shè)置單泵流速梯度洗脫，同時檢測了NE,DA和5-HT,樣品的洗脫時間得到明顯縮短。1材料和方法1.1儀器和試劑島津LC-10Atvp系列：RF-10AXL熒光檢測器

7、，LC-10Atvp高壓泵，Rheodyne7725進(jìn)樣閥。Heraeus公司Labofuge400R冷凍離心機(jī)。DA,5-HT,NE和磷酸二氫鉀（KH2PO4）均為Sigma公司收稿日期：2004-02-04作者簡介：張雷.男，碩士研究生，E-mail：zl78213.通訊聯(lián)系人：鄭筱洋.女.教授.博士生導(dǎo)主要從事系統(tǒng)與定量生理學(xué)研究,E-mail；z6>.第1期張雷等：高效液相色譜法-熒光檢測流速梯度法測定去卵巢小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)77產(chǎn)品；甲醇為國產(chǎn)HPLC色譜純，高氯酸和鹽酸為國產(chǎn)分析純。12標(biāo)準(zhǔn)品和腦勻漿樣品的制備準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品NE4.23mg,DA47.40mg,5-HT5

8、3.18mg,分別溶于0.1mol/LHC1中，并定容于25mL容量瓶，制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（NE5mmol/L,DA10mmol/L,5-HT10mmol/L）o再按需要用0.1mol/LHC1稀釋成各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。腦勻漿樣品的制備：小鼠直接斷頭，在冰臺上剝離出小鼠全腦（保留大腦及間腦），稱重。按0.1g腦（濕重）加入1mL5%高氯酸的比例加入高氯酸，放入玻璃勻漿管內(nèi)，冰浴下勻漿。將勻漿液收集于1.5mL離心管中，于13000r/min下低溫離心20min,取上清液進(jìn)樣檢測。13色譜條件Shim-pack柱，6.0mmi.d.x150mm,5m；流動相：0.1mol/L的KH2PO4緩沖液-甲

9、醇（體積比為9：l）o單泵流速線性梯度程序：0.510min2.5minmL/min1mL/min1.5mL/min（保持18min）*0.5mL/min；進(jìn)樣環(huán)體積為20|xL；柱溫為室溫；熒光檢測器的激發(fā)波長為254nm,發(fā)射波長為338nm02實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1線性范圍和檢測限采用外標(biāo)法，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣測定，以峰面積丫為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣濃度X（”nol/L）為橫坐標(biāo)作圖，計(jì)算出線性回歸方程（如表1）。以S/N=3汁得到方法的最低檢測限分別為：NE5nmol/L,DA10nmol/L,5-HT5nmol/Lo衰1NE.DA和5-HT的城性回歸方程Table1Regressionequati

10、onsofNE,DAand5-HTy：Peakarea；X：concentrationofsample,“mol/L.CompoundLinearrange/(|imol/L)Regressionequation*rNE0.05-20Y=547740X+4302.80.9999DA0.10-25Y=379769X0.98915-HTO.OO5-I.2F=8x!06X0.99972.2色譜分離和保留時間標(biāo)準(zhǔn)液和腦勻漿樣品中的NE,DA和5-HT的峰之間分離較好（樣品中NE與雜質(zhì)峰的分離尚有待改善），保留時間分別在5,7和12min左右。腦勻漿中的各種雜質(zhì)峰均在20min內(nèi)洗脫完畢，且雜質(zhì)峰對結(jié)果

11、無干擾。色譜圖見圖1和圖2（由于生物樣品的日間變異因素，個別物質(zhì)在不同樣品中的保留時間稍有出入）。圖13種神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的色譜圖Fig.1Chromatogramofthemixtureofthreestandards圖2腦勾漿樣品色謂圖Fig.2Chromatogramofabrainsampleofovariectomizedmice2.3回收率的測定將混合標(biāo)準(zhǔn)液定量地加入5份未處理過的腦勻漿樣品中，進(jìn)樣后測定，結(jié)果見表2。衰2NE,DA和5-HT的回收率測定（n=5）2.4方法的精密度Table2DeterminationofrecoveryofNE,DAand5-HT(n-5)Comp

12、oundAdded/(p.mol/L)Found/(p.mol/L)Recovery(5±SD)/%NE0.54390.464885.45±2.431.08780.922584.80±1.811.63171.417286.85t1.33DA0.33240.318695.86±3.660.66480.642996.71±1.420.99720.967997.06±0.895-HT0.25320.213784.38t1.790.50640.424183.74i1.370.75960.643284.68±2.27連續(xù)測定混合標(biāo)準(zhǔn)液

13、6次，NE,DA和5-HT的峰面積日內(nèi)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.83%,1.18%和3.03%。2.5樣品測定應(yīng)用所建立的方法對雙側(cè)去卵巢（OVX）一個月后的小鼠腦內(nèi)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行測定，并-78-第23卷與對照組進(jìn)行比較（結(jié)果見表3）,發(fā)現(xiàn)小鼠在去卵巢一個月后，由于體內(nèi)雌激素水平下降，腦內(nèi)DA的含量比對照組顯著性升高（P<0.01）,而NE和5-HT的含量變化卻沒有顯著差異。衰3去卵M(OVX)小M腦內(nèi)NE,DA和S-HT水平的變化Table3ChangeofthelevelsofNE,DAand5-HTinthebrainsofovarlelomized(OVX)miceg/g

14、CompoundOVX(x±SD)Control(x±SD)(n=8)(n=11)NE3.84±0.443.97±0.54DA2.35±0.56,1.7110.255-HT0.6110.100.62±0.10Note：P<0.01vscontrol.3討論據(jù)研究，許多疾病的發(fā)生和體內(nèi)的雌激素水平有密切關(guān)系，如阿爾茨海默病（AD）、帕金森氏病（PD）等，其中的機(jī)制之一就是影響了中樞單胺能神經(jīng)特別是多巴胺（DA）系統(tǒng)的功能'。本實(shí)驗(yàn)采用島津Cm柱，用熒光檢測器測定了小鼠雙側(cè)去卵巢后腦內(nèi)單胺能神經(jīng)遞質(zhì)的變化。由于NE和DA出峰

15、較早,5-HT的出峰時間較為拖后，故采用梯度洗脫；又由于NE在流動相流速較高時不易與雜質(zhì)峰分離，故在設(shè)置單泵流速梯度時，開始階段調(diào)低流動相流速，使NE充分分離，而后提高流動相流速，使5-HT較快出峰，并使更多的雜質(zhì)較快洗脫。.本方法不僅靈敏度高，特異性強(qiáng)，而且使整個樣品的洗脫時間較短，可用于血液、體液等生物樣品中NE,DA和5-HT的測定。參考文獻(xiàn)：1XuShaofen.Neurobiology.2nded.Shanghai:ShanghaiMedicalUniversityPress(許紹芬.神經(jīng)生物學(xué).第2版.上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社)1999.119(2：TangAiguo.WuHong

16、,GaoJiesheng.YangXilan.ChineseJournalofChromatography(唐愛國，吳表，高潔生，播鋸蘭.色譜)1995.13(6)：4723 WangLili,GuoZhian,ZhaoDehua,MetQibing.ChineseJournalofChromatography(王莉莉.郭治安，趙德化，梅其炳.色譜).1999.17(2)：223HuangTichua,KissingerPT.ChineseJournalofAnalyticalChemistry(黃鐵華.KissingerPT.分析化學(xué)).1998.26(6)；7484 QuZhiwei,LiuYun,ZhangJuntian.ActaAcademiaeMe-dicinaeSinicae(屈志煒.劉云.張均HL中國陜學(xué)科學(xué)院學(xué)報)，1987,9(5)：371MuraiS,SaitoH.MasudaY,ItohT.JNeurochem,1988,50(2)：4737NieWei,ZhangYongxiang.ChineseJournalofPharmacologyandToxicology(偉，張永祥.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志).2001,15(5):3