1、槐定堿預防小鼠內毒素性肝損傷的作用及對肝臟CD14、TLR4表達的影響 作者：王琳琳，周婭，梁錦屏，黃菱，高曉峰，劉靜，王寧萍，趙建寧【摘要】 目的 研究預防性給予槐定堿對小鼠內毒素血癥急性肝損傷的影響及對CD14、TLR4表達的調節。方法 觀察槐定堿12、6、4mg/kg三個劑量預防性處理的小鼠，在給予內毒素后2、6、12、24h時各組小鼠一般狀況、肉眼及光鏡下肝組織的病理變化，賴氏法測定血清丙氨酸氨基轉氨酶(ALT)濃度，RT-PCR與Western Blot分別檢測肝組織CD14及 TLR4 的 mRNA 與蛋白表達，放免法檢測血清TNF-含量的變化。結果 槐定堿三個劑量預防性給予，各個

2、時間點結果均表明改善了內毒素血癥模型小鼠的一般狀況，減輕了肝組織病理改變；槐定堿三個劑量組的ALT值均低于同時間點的LPS模型組（P0.01或P0.05）；槐定堿三個劑量組與同時間點LPS模型組比較，均下調肝組織CD14 、TLR4 mRNA和蛋白的表達（P0.01或P0.05）；槐定堿三個劑量組血清TNF-水平均較同時間點LPS模型組降低（P0.01或P0.05），并在24h時均降至正常對照組水平。結論 槐定堿12、6、4mg/kg三個劑量預防性給予，可抑制內毒素血癥小鼠肝臟炎癥反應，其機制可能與下調LPS識別受體CD14、TLR4表達，并進而抑制下游炎癥因子分泌有關。 【關鍵詞】 苦豆子；

3、槐定堿；內毒素；肝臟；CD14；Toll樣受體4Abstract: Objective To observe the preventive effect of Sophoridine on liver inflammatory reaction of mice with endotoxemia，and its effect on the expression of CD14 and TLR4.Methods The ICR mice were administered by three dosage of Sophoridine, that was high doses (12mg/kg),

4、middle doses（6mg/kg）and low doses（4mg/kg）. 2，6，12，24 hours after LPS injection, general symptoms were recorded,the blood and liver samples were taken and pathological damages of liver were checked. The level of alanine aminotransaminase(ALT) in serum was measured by Reitman mensurate rating. Reverse

5、 transcription polymerase chain reaction (RTPCR) was employed to detect the mRNA expression of CD14 and TLR4 in liver. Protein expression of CD14 and TLR4 in liver were assessed by Western Blot. Serum TNF levels were determined by radio immunoassay. Results The results of three dosage of Sophoridine

6、 pretreated groups at each timepoint showed that Sophoridine could ameliorate the general symptoms of endotoxic liver injury models significantly and decrease pathological damage of liver tissue. The three Sophoridine group with different doses showd a significantly lower ALT value than that in the

7、LPS model at the same time point（P0.01 or P0.05）； compare to the LPS model, the express of CD14 , TLR4 mRNA and proteins in the liver of the three different doses sophoridine group were downregulated significantly（P0.01 or P0.05）, and the levels of serum TNF of three Sophoridine group were significa

8、ntly reduced than those in the LPS model at the same time point（P0.01 or P0.05）, and they reached the level of normal control groups at 24h.Conclusion The mechanism of Sophoridine antiendotoxin liver injury had a strong relation with downregulating of the expression of CD14 and TLR4, and influence o

9、f TLR4 transduction pathway, and restraining secretion of downstream inflammatory factors.Key words: sophora alopecuroides L; sophoridine; endotoxin; liver; CD14；toll like receptor細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），即內毒素（endotoxin，ET），是革蘭陰性菌（G-菌）的主要病原相關分子模式。G-菌感染引起膿毒癥，并進一步導致多器官功能障礙綜合征，內毒素是主要病原因素之一。因為抗內毒素藥

10、物缺如，內毒素所致疾病一直是臨床治療的棘手難題1-3。近年來，Toll樣受體4（TLR4）信號轉導通路的發現為人們攻克內毒素所致疾病提供了新的方向，將該轉導通路中的信號受體作為靶位, 以阻斷炎癥的級聯反應,從而防止失控性炎癥發生，已成為開發新的抗內毒素藥物的途徑之一。苦豆子(Sophora alopecuroides L)為豆科槐屬植物，槐定堿是苦豆子中含量較高的生物堿之一。本課題組以往研究發現，槐定堿對內毒素肺損傷小鼠模型具有顯著的保護效應4，有必要對其進行更為深入的研究。肝臟是機體清除內毒素的主要器官，同時也是內毒素血癥時受損最早、最明顯的靶器官之一5。本研究通過建立小鼠內毒素血癥急性肝損

11、傷模型，觀察預防性給予槐定堿對小鼠內毒素性肝損傷的作用，探討其作用是否與調節LPS 識別受體CD14、TLR4表達有關。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 主要試劑和儀器LPS(E.coli 055B5), Sigma公司產品;槐定堿(批號:960324 ，mp 109，含量98%以上)購于寧夏藥物研究所; 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒購于北京北化康泰臨床試劑有限公司；RT-PCR試劑盒購于美國Promega公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于江蘇碧云天生物技術有限公司；兔抗小鼠TLR4、 CD14多克隆抗體購于美國Santa Cruz 公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物有

12、限公司；小鼠TNF-放免分析試劑盒購于北京科美東雅生物技術有限公司。1.1.2 動物ICR小鼠,清潔級,均為雄性,68周齡,1822 g,寧夏醫科大學實驗動物中心提供,動物許可證號：SCXK(寧)2005-0001。1.2 方法1.2.1 藥物參照小鼠腹腔注射槐定堿的LD50（58.0 mg/kg）6，實驗選用槐定堿約1/5、1/10、1/15 LD50三個劑量。1.2.2 動物模型制備與分組ICR小鼠腹腔注射LPS(E.coli 055：B5)10 mg/kg(經預試驗選定)制備小鼠內毒素血癥急性肝損傷模型。 實驗小鼠隨機分為5組，每組20只，即正常對照組；內毒素肝損傷模型組；組分別為槐定堿

13、高劑量（12mg/kg ）、中劑量 （6mg/kg ）、低劑量 （4mg/kg ）組。組小鼠腹腔注射0.2mL/10g生理鹽水，組小鼠每天分別腹腔注射槐定堿高、中、低劑量，連續3d；然后，除組末次注射后30min腹腔注射生理鹽水0.2mL外，組均在末次注射后30min腹腔注射LPS 10mg/kg； 隨后各組分別在注射LPS后2 、6 、12 、24h四個時間點隨機抽取5只小鼠，進行觀察檢測。1.2.3 觀察指標各組小鼠分別在給予 LPS后相應時間點記錄一般狀況并取材，賴氏法測定血清丙氨酸氨基轉氨酶(ALT)濃度：摘小鼠眼球取血置小試管中，血液凝固后，3000r/min離心10min，吸取血清

14、，按ALT檢測試劑盒說明書進行操作；肝臟的病理變化：肉眼觀察肝臟形態、色澤、包膜等的改變；取各肝右葉同一部位，置10%中性福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定后,石蠟包埋,HE染色,光鏡觀察肝組織的病理變化； RT-PCR檢測肝組織CD14和TLR4 mRNA表達水平：PCR引物由北京賽百盛公司合成。 TLR4引物：5'GCAATGTCTCTGGCAGGTGTA 3'，5'CAAGGGATAAGAACGCTGAGA 3',片段長度為406bp; CDl4引物：5'TTGCGGAGGTTCAAG ATG 3'，5'TGTGGACACGGAAGCAGA

15、3',片段長度為237bp; -actin引物：5'TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC3'，5'TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG3',片段長度為350bp。 提取小鼠肝組織總 RN，采用Promega公司的一步法 RT-PCR 試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作；PCR產物電泳凝膠置于凝膠圖像分析系統成像，以 Bio-Image Analysis System 進行半定量分析，結果以相對光密度值 (relative optical density, ROD)×面積(mm2)表示；Western-Blot檢測肝組織

16、CD14和TLR4蛋白表達水平：提取標本的總蛋白；測定樣品蛋白濃度（BCA法）；行SDS-PAGE后，用凝膠圖像分析成像系統進行掃描分析，以目的條帶面積灰度值/內參（-actin）條帶面積灰度值做為半定量檢測結果；放射免疫分析法檢測血清腫瘤壞死因子（TNF-）含量：取血清，按試劑盒說明書操作，放免計數儀檢測，打印出數值。1.3 統計學方法 實驗數據以均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析進行組間差異表示。應用SPSS11.5軟件進行統計學處理，多樣本均數間比較采用One-Way ANOVA檢驗，以P0.05為差異有統計學意義。2 結果2.1 小鼠一般狀況的改變 正常對

17、照組小鼠在各時間點均活動自如，進食正常，無病態；槐定堿各劑量組小鼠于末次給藥后30min，注射LPS， 2h 時各劑量組小鼠均見活動減少；6h時蜷縮無力，進食減少，低劑量組有口唇發紫，個別有腹瀉癥狀，但高、中劑量組未見口唇發紫及腹瀉；12h時各劑量組前述癥狀緩解；24h時各劑量組小鼠進食、活動基本恢復正常。各時間點的一般狀況均明顯好于同時間點LPS模型組。各實驗組小鼠均無死亡。2.2 小鼠肝臟的病理學觀察2.2.1 大體觀察正常對照組小鼠肝臟形態正常，色澤紅潤，包膜光滑，質地柔軟。槐定堿各劑量處理小鼠給予LPS后2h 及6h肝臟無明顯肉眼可見變化；12h時各劑量組小鼠肝臟均有輕微腫脹；24h時

18、肝臟腫脹較明顯，其中低劑量組的部分小鼠肝臟表面可見點狀及片狀出血點。但與LPS模型組12h及24h時間點相比，槐定堿各劑量組小鼠肝臟充血水腫程度較輕，中、高劑量組未見肝表面有出血點。 光鏡觀察：正常對照組各時間點肝細胞形態結構正常，肝索排列整齊，未見炎性細胞。LPS模型組2h時無明顯變化；6h時肝小葉內血管擴張充血，肝細胞輕微腫脹、有散在炎性細胞浸潤；12h時除上述病變更為明顯外，部分區域有散在點狀及小灶狀壞死，部分肝細胞出現雙核現象；24h時可見小葉內肝竇擴張充血，肝細胞氣球樣變，壞死部位見較多淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，匯管區可見血管擴張充血及炎細胞浸潤。槐定堿各劑量組較同時間點LPS組病變

19、明顯減輕，24h時病變減輕尤為明顯。槐定堿高、中劑量組病變輕于低劑量組。參見圖1(見封3)。2.3 小鼠血清中ALT含量測定 槐定堿三個劑量組的ALT值在2、6h時間點變化曲線與LPS模型組相仿，但均低于同時間點的LPS模型組（P0.01或P0.05），12h時，LPS模型組的ALT值升至頂峰，而槐定堿三個劑量組則趨于下降，至24h時除低劑量組外均已達到正常水平。 槐定堿高、中劑量組在2、6、24h時間點的降ALT效應明顯強于低劑量組（均P0.05），說明槐定堿降低小鼠血清ALT作用具有一定的量-效關系，高、中劑量組優于低劑量組,見圖2。2.4 小鼠肝組織中CD14 與 TLR4 的mRNA表

20、達2.4.1 肝組織中CD14 mRNA表達 槐定堿高劑量組在給予 LPS后各時間點肝組織 CD14mRNA表達水平均低于LPS模型組（P均0.01），而與正常對照組差異無統計學意義；中劑量組各時間點CD14mRNA表達水平亦均顯著低于LPS模型組（P均0.01），僅6h時間點CD14mRNA表達明顯高于正常對照組；而低劑量組在2、12、24h時間點CD14mRNA表達水平雖均低于LPS模型組（P0.05或 P0.01），但從2h 起，至12h時均仍明顯高于正常對照組（P0.05或 P0.01），24h時才接近正常對照組水平，見圖3、4。2.4.2 肝組織中TLR4 mRNA表達 模型組小鼠給

21、予 LPS后2h肝組織 TLR4 mRNA表達開始上調，并迅速于 6h 達高峰，以后開始下降（P0.01），至 24h 時接近正常對照組水平。槐定堿三個劑量組在給予LPS后TLR4 mRNA表達趨勢與LPS模型組相似, 但與同時間點LPS模型組比較，槐定堿三個劑量均表現出下調TLR4 mRNA作用，至12h 除低劑量組外，高、中劑量組已接近正常對照組水平，見圖5、6。2.5 小鼠肝組織中CD14、 TLR4的蛋白表達2.5.1 肝組織中CD14蛋白表達 模型組在給予 LPS后各時間點CD14蛋白表達趨勢與其mRNA表達基本一致。2h肝組織中 CD14蛋白表達開始明顯上調，并迅速于 6h 達高峰

22、，以后開始下降，至 24h 仍明顯高于正常對照組（P0.05），差異有統計學意義。槐定堿高、中、低劑量組在給予LPS后CD14蛋白表達趨勢與LPS模型組相似，但除6h低劑量組外各時間點的CD14蛋白表達均顯著低于同時間點LPS模型組（P0.01或P0.05），見圖7、8。2.5.2 肝組織中 TLR4 蛋白表達 LPS模型組小鼠各時間點TLR4蛋白表達趨勢與其mRNA表達基本一致。2h肝組織 TLR4蛋白表達開始上調，于 6h 達高峰（P0.01），以后開始下降（P0.05），24h 時已接近正常對照組水平。槐定堿高、中、低劑量組在給予LPS后2 h 的TLR4蛋白表達均與正常對照組無統計學意

23、義，至6h三個劑量組的TLR4蛋白表達均達高峰，但在12h時均已較LPS模型組提前下調至接近正常對照組水平，見圖9、10。2.6 血清中TNF-含量 槐定堿三個劑量處理小鼠給予LPS后血清TNF-水平均較同時間點LPS模型組顯著降低（P0.01或P0.05），并在24h時均降至正常對照組水平。槐定堿三個劑量組之間下調血清TNF-的效應差異無統計學意義，見圖11。3 討論 本研究用槐定堿高（12mg/kg）、中（6mg/kg）、低（4mg/kg）三個劑量預防性給予急性內毒素血癥肝損傷模型小鼠，動態觀察各個時間點結果，均表明顯著改善了模型小鼠的一般狀況，減輕了肝組織病理損傷，顯著降低血清ALT含量

24、，其作用還呈現出一定的量-效關系。說明槐定堿具有阻斷內毒素性肝臟炎癥反應，減輕組織損傷的作用。 CD14、TLR4是細胞膜表面的LPS識別受體，LPS結合脂多糖結合蛋白(LBP)與mCD14后, 需借助跨膜的TLR4向胞內轉導LPS信號。內毒素所致膿毒癥主要是由于TLR4轉導通路下游炎癥因子的失控性釋放，引起組織損傷和器官功能紊亂所致。因此目前認為CD14、TLR4是內毒素所致炎癥反應發生的起步點，在炎癥級聯反應中具有類似于“閥門”樣的作用7-8。調節內毒素信號轉導最上游的關鍵分子，影響細胞對LPS的識別，使機體對LPS的炎癥反應不至過強，可能成為有效防治膿毒癥發生發展的重要方法。本研究結果表

25、明槐定堿可下調肝組織CD14及TLR4的mRNA和蛋白表達，因而可減少LPS與CD14、TLR4的結合，抑制下游炎癥因子表達，減輕內毒素的損傷效應。 TNF-是公認的致炎細胞因子。已有報道膿毒癥大鼠肝臟組織TLR4mRNA及TNF-mRNA的表達呈顯著正相關9,也就是說，TLR4 mRNA的表達增高,下游炎癥因子TNF-合成、分泌即增多，反之亦然。內毒素通過激活肝臟Kupffer細胞（KCs）釋放大量TNF-等炎性細胞因子，不但直接損害肝細胞，還使肝臟清除內毒素能力下降而加重內毒素血癥，再促進TNF-產生。TNF-大量分泌再加重肝細胞損傷，并成為引起后續多器官損傷的重要環節。故本研究中選擇檢測

26、血清中TNF-作為指示槐定堿調節CD14、TLR4表達，影響下游炎癥因子表達的指標。本研究中槐定堿三個劑量預防性給予模型小鼠在各個時間點都顯著降低血清TNF-水平（P0.01或P0.05），并在24h時均已達到正常對照組水平。此結果表明槐定堿下調肝組織CD14和TLR4表達與下調血清TNF-含量的一致性，再結合上述槐定堿阻斷內毒素性肝臟炎癥反應，對內毒素血癥小鼠的保護作用，說明槐定堿減輕內毒素性肝損傷的作用機制與其調節細胞表面LPS的模式識別受體CD14和TLR4的表達，并進而影響LPS的細胞內信號轉導通路，抑制下游炎癥因子表達有關。 當然除CD14和TLR4外，在LPS炎癥信號轉導通路上還有其它上游和下游受體及轉導分子，各自都有固定的功能，槐定堿對它們的作用還有待于深入研究。【參考